陳光朗等

摘要[目的]研究擬南芥AtXCD1蛋白的原核表達(dá)。[方法]構(gòu)建XCD1原核表達(dá)載體，根據(jù)NCBI基因序列設(shè)計(jì)引物，并以PCR擴(kuò)增得到大量目的片段XCD1，將XCD1連接到原核表達(dá)載體pET32a+，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌原核表達(dá)菌株BL21（DE3），對(duì)蛋白表達(dá)條件：誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度等進(jìn)行優(yōu)化。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得目的蛋白，對(duì)蛋白表達(dá)條件：誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度等進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]XCD1序列全長(zhǎng)為1 242 bp，與PCR產(chǎn)物大小一致。蛋白XCD1pET32a+較適表達(dá)條件為在30 ℃ 0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)1.5 h。[結(jié)論]該結(jié)果為進(jìn)一步蛋白純化及酶活測(cè)定試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞擬南芥（Arabidopsis thaliama）；AtXCD1；重組載體；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)S188；Q753文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）14-04197-02

Prokaryotic Expression of Arabidopsis AtXCD1 Fusion Proteins

CHEN Guanglang， CAO Shuqing et al（School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009）

Abstract[Objective] To study prokaryotic expression of Arabidopsis AtXCD1 protein. [Method] To construct the prokaryotic expression plasmid of XCD1， the XCD1 encoding sequence was proliferated by PCR under the direction of the primers designed according to the sequence obtained from NCBI website. Then the cDNA fragments were cloned into prokaryotic expression vectors pET32a+ and sequenced. In addition， recombinant plasmids were transformed into E.coli. BL21 （DE3） for expression. Expression of AtXCD1 was induced to generate their fusion proteins by IPTG， and the protein expression conditions were optimized， such as time， temperature and IPTG concentration. [Result] The whole length of XCD1 sequence is 1 242 bp， the size is the same as PCR products. The proper expression conditions of protein XCD1pET32a+ is 30 ℃ 0.1mmol/L， IPTG induction for 1.5 h. [Conclusion] The study will lay a foundation for further protein purification and enzyme activity determination.

Key wordsArabidopsis； AtXCD1； Recombinant plasmid； Prokaryotic expression

面對(duì)日益嚴(yán)重的重金屬污染尤其是土壤污染問(wèn)題，尋找耐受重金屬的植物修復(fù)基因并闡明其功能機(jī)制具有重要的理論及實(shí)踐意義[1]。鎘（Cd）是最具毒性的重金屬元素之一，其化合物可溶于水，具有很強(qiáng)的生物遷移性，極易被植物吸收并積累[2]，Cd2+被作物富集吸收進(jìn)入食物鏈，進(jìn)而引起骨質(zhì)疏松、貧血、高血壓以及腎損傷等疾病[3]。很多基因都參與重金屬鎘的脫毒途徑，如AtATM3、AtPCR1、AtPDR8和AtGSH1等[4-6]。實(shí)驗(yàn)室對(duì)AtXCD1基因的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把XCD1基因敲除后，敲除突變體對(duì)鎘的脅迫表現(xiàn)為敏感，根長(zhǎng)鮮重等生理指標(biāo)都比野生型低。當(dāng)利用35S過(guò)量表達(dá)載體獲得XCD1過(guò)量表達(dá)株系，過(guò)量表達(dá)株系對(duì)鎘的脅迫表現(xiàn)為耐受，這與敲除突變體的敏感表型相一致。這說(shuō)明XCD1基因極有可能參與擬南芥對(duì)鎘的響應(yīng)調(diào)控。

根據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)的基因組序列，XCD1（At3g10890）基因編碼一個(gè)（1，4）β甘露聚糖內(nèi)水解酶。β甘露聚糖內(nèi)水解酶可以將植物體內(nèi)的甘露聚糖和半纖維素等水解成甘露糖等小分子，甘露糖可能作為信號(hào)分子間接調(diào)節(jié)GSH途徑。為了深入研究XCD1基因參與鎘耐受的機(jī)理，筆者構(gòu)建XCD1pET32a+重組載體并將其轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株BL21中，探索其合適的表達(dá)條件，以期為下一步酶活測(cè)定及其他蛋白試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 研究對(duì)象。野生型擬南芥（Arabidopsis thaliama），記作為（WildType，WT），由美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源庫(kù)提供，后由實(shí)驗(yàn)室繁育保存。

1.1.2供試菌株和載體。感受態(tài)細(xì)胞DH5α、原核表達(dá)大腸桿菌菌株BL21和原核表達(dá)載體pET32a+，由實(shí)驗(yàn)室繁育保存。

1.1.3主要試劑。RNAiso Plus總RNA抽提試劑盒和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購(gòu)自Fermentas公司；限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I、T4 DNA連接酶、Easy Taq和BL21感受態(tài)細(xì)胞等，均購(gòu)自北京Transgen公司； TIAN Gel MiDi Purification Kit、TIAN quick MiDi Purification Kit和TIAN prep Mini Plasmid kit，均購(gòu)自天根公司。

1.2方法

1.2.1擬南芥AtXCD1基因克隆。提取擬南芥總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。根據(jù)TAIR網(wǎng)站提供的XCD1基因的CDS序列，結(jié)合載體上的酶切位點(diǎn)，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)XCD1兩端引物。最終設(shè)計(jì)獲得的引物和酶切位點(diǎn)如下，F(xiàn)P：N N N ggatc cAT GAA GTG TT TGT GTT TTGTCG（BamHⅠ），RP：NNN ctc gag AATTTTAGTTTTTGATAACT TTCCTT（XhoⅠ）。

1.2.2擴(kuò)增條件。以cDNA為模板，用PrimeSTAR MAX DNA Polymerase高保真酶擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，25 ℃保存。擴(kuò)增完成后，制備1%瓊脂糖TAE電泳膠，驗(yàn)證產(chǎn)物條帶大小是否與目的條帶大小相符[7]，若大小相符，用TIANGel MiDi Purification Kit對(duì)擴(kuò)增的基因產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.3XCD1pET32a+原核表達(dá)載體的構(gòu)建。用LA液體培養(yǎng)基大量擴(kuò)培含pET32a+載體的大腸桿菌，用TIANprep MiniPlasmid kit提取質(zhì)粒，并驗(yàn)證大小是否相符。用BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)純化好的XCD1基因和pET32a+質(zhì)粒進(jìn)行37 ℃雙酶切2 h，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖切膠回收，回收后基因和質(zhì)粒按照5∶1的體積比16 ℃連接過(guò)夜。熱激轉(zhuǎn)化并涂板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落后加入液體培養(yǎng)基擴(kuò)培，進(jìn)行菌落PCR。挑取較亮條帶對(duì)應(yīng)的菌送測(cè)序。若測(cè)序成功，即獲得重組載體。

1.2.4目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。將成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的原核表達(dá)菌先37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入IPTG，再將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至30 ℃環(huán)境中誘導(dǎo)培養(yǎng)。設(shè)置空白質(zhì)粒作對(duì)照，嘗試不同濃度的IPTG誘導(dǎo)量及誘導(dǎo)時(shí)間，以確定較適合的誘導(dǎo)條件。取不同處理?xiàng)l件下的原核表達(dá)菌1 ml，離心收集沉淀，用PBS洗菌體沉淀2次，加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，離心取上清，用20 μl進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。

1.2.5SDSPAGE電泳。組裝好制膠模具，先灌入適量的12%聚丙烯酰胺分離膠，待其凝固后再灌入5%的濃縮膠，放置加樣梳，待濃縮膠凝固，小心取下加樣梳，即制好電泳膠。將電泳膠移至電泳槽，加入電泳緩沖液，并上樣。先以80 V恒壓電泳，待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓改為120 V恒壓，電泳至溴酚藍(lán)指示劑到分離膠底部，停止電泳[8-9]。打開(kāi)模具，取下電泳膠，置于12 cm玻璃皿中，加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮蘭R250 染色液，在水平搖床上搖動(dòng)染色3 h。倒出染色液后，在平皿中加入適量甲醇脫色液，于水平染色搖床上緩慢搖動(dòng)，脫色至背景清晰。拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果用于后期分析。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增擬南芥AtXCD1基因以擬南芥總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，加入設(shè)計(jì)好的XCD1序列兩端引物及其他試劑，擴(kuò)增目的片段。電泳結(jié)果如圖1所示，XCD1序列全長(zhǎng)為1 242 bp，與PCR產(chǎn)物大小一致。同時(shí)，提取了pET32a+質(zhì)粒，電泳檢測(cè)證明大小合適。

圖1PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒檢測(cè)2.2目的基因與質(zhì)粒的酶切連接轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性驗(yàn)證挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR，結(jié)果如圖2所示，2號(hào)菌和3號(hào)菌為陽(yáng)性菌，大小與目的條帶一致。

圖2菌落PCR結(jié)果2.3目的蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化為使目的蛋白在原核菌株中具有較合適的表達(dá)條件，分別對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行探索。圖3中ABC綜合分析確定，蛋白表達(dá)的影響。

圖3目的蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)主要介紹了XCD1pET32a+重組載體的構(gòu)建和其在原核細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)及合適誘導(dǎo)表達(dá)條件的探索等問(wèn)題，最終確定蛋白XCD1pET32a+在30 ℃ 0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)1.5 h為較適表達(dá)條件，為下一步酶活測(cè)定及蛋白純化等試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。隨著一些抗逆基因的鑒定和抗逆機(jī)理不斷被深入研究，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源抗逆基因?qū)胫参锘蚪M，在提高植物抗逆性、改良農(nóng)作物遺傳性狀及培育農(nóng)作物優(yōu)良品系等方面具有廣闊的應(yīng)用前景及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[10]。

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