【中圖分類號(hào)】R155 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）02-0758-02

諾如病毒（Norovirus NoV）又稱諾瓦克病毒（Norwalk-like viruses），屬杯狀病毒科諾如病毒屬，是引起病毒性胃腸炎的重要病原體[1]。NoV是美國(guó)學(xué)者Kapikian于1972年通過(guò)免疫電鏡技術(shù)首先在發(fā)生于美國(guó)俄亥俄州諾瓦克鎮(zhèn)暴發(fā)腹瀉疫情患者糞便中發(fā)現(xiàn)的病毒顆粒[2]。NoV為單股正鏈RNA病毒，是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。由于目前不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和沒有動(dòng)物模型不能進(jìn)行中和試驗(yàn)，NoV目前無(wú)法進(jìn)行經(jīng)典的血清分型[3-5]。該組病毒極易變異，此后在其他地區(qū)又相繼發(fā)現(xiàn)并命名了多種類似病毒，統(tǒng)稱為諾如病毒。由于NoV遺傳的高度變異，在同一時(shí)期和同一社區(qū)內(nèi)可能存在遺傳特性不同的毒株流行。NoV抗體沒有顯著的保護(hù)作用，尤其是沒有長(zhǎng)期免疫保護(hù)作用，極易造成反復(fù)感染[6]。大多數(shù)感染者在1～3天后好轉(zhuǎn)，但小孩、老人和低免疫力低下者可能導(dǎo)致嚴(yán)重脫水[7]。

諾如病毒感染性強(qiáng)，以腸道傳播為主，可通過(guò)污染的水源、食物、物品、空氣等傳播，常在社區(qū)、學(xué)校、餐館、醫(yī)院、托兒所、孤老院及軍隊(duì)等處引起集體暴發(fā)。1995年，我國(guó)報(bào)道了首例NoV感染[8]，之后山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州等地區(qū)先后發(fā)生多起NoV感染性腹瀉暴發(fā)疫情，在我國(guó)5歲以下腹瀉兒童中，NoV檢出率為19%左右[9]。以前由于檢驗(yàn)技術(shù)的滯后使得許多NoV感染病例無(wú)法確診。本文綜述NoV檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，為NoV的防控提供理論支持。

1 電鏡法

電鏡法包括直接電鏡法（EM）、免疫電鏡法（IEM）和固相免疫電鏡法（SPIEM）。EM法觀察的靈敏度較低，要求每毫升糞便樣品中至少有大約106個(gè)病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出時(shí)采集的樣本檢測(cè)。IEM法比EM法的敏感性可提高100倍，主要應(yīng)用患者恢復(fù)期血清捕捉同型抗原，從而增加檢出率。SPIEM法是將特異性抗體直接包被載網(wǎng)，同時(shí)加入蛋白A增加抗體與抗原接觸的機(jī)會(huì)，從而增加檢出的靈敏度。方肇寅[9]等曾用20份便樣上清液滴膜后，2%PTA（pH 6.4）染色直接電鏡觀察在國(guó)內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)了諾瓦克樣病毒。電鏡法的缺陷在于要求觀察者有豐富的經(jīng)驗(yàn)，精密的檢測(cè)儀器和較大的勞動(dòng)強(qiáng)度，靈敏度相對(duì)較低，檢出陽(yáng)性率只達(dá)10-20%，制約了該方法的在NoV檢測(cè)中的應(yīng)用[10]，不適于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。

2 免疫法

免疫學(xué)檢測(cè)法（EIR）包括放射免疫法（RIA）、生物素-親和素免疫法（Biotin-Avidin Immun-oassy）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和免疫層析技術(shù)。

2.1 RIA法和生物素-親和素免疫法

RIA法的靈敏度比IEM法可提高10～100倍，可以檢測(cè)出抗體升高的水平，為流行病學(xué)提供更有參考價(jià)值的資料。RIA法的不足之處在于它需要6d，且需要放射性同位素標(biāo)記。為了簡(jiǎn)化方法，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心建立了生物素-親和素免疫法，其靈敏度與RIA法相當(dāng)，目前該方法已成為美國(guó)疾病預(yù)防控制中心檢測(cè)NoV抗原和抗體的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法之一。

2.2 ELISA法

1992年Jiang等重組桿狀病毒表達(dá)NoV衣殼蛋白成功后，建立起的NoV酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)，其不足之處是免疫反應(yīng)的株型特異性太強(qiáng)，所以應(yīng)用范圍還比較窄。陳冬梅[12]等用日本贈(zèng)送的NoV檢測(cè)試劑盒檢測(cè)糞便中NoV，分別用NoV GGⅠ、GGⅡ特異性單克隆抗體包被微孔板中的不同小孔捕獲糞便標(biāo)本中的NoV抗原，然后用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗NoV特異性多克隆抗體檢測(cè)，所以不同的小孔可同時(shí)分別檢測(cè)GGⅠ、GGⅡ型NoV。共檢測(cè)167份糞便標(biāo)本，GGⅠ型陽(yáng)性20份、GGⅡ型陽(yáng)性19份，GGⅠ型、GGⅡ型同時(shí)陽(yáng)性7份，總陽(yáng)性率27.5%（46/167）。Moe等開發(fā)一種利用NoV的重組抗原檢測(cè)唾液中特異性IgA和IgG抗體的ELSIA方法。對(duì)該法的評(píng)估表明其靈敏度和特異性分別達(dá)到100%和95%，但上述結(jié)果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。該方法采樣方便，提供了一種檢測(cè)血清抗體之外的新途徑[13]。由于NoV培養(yǎng)還未成功，原來(lái)用作試劑的病毒抗原數(shù)量受到限制，現(xiàn)在，用分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以人工重組NoV的衣殼蛋白，從而解決了上述問(wèn)題。酶聯(lián)免疫法特異性強(qiáng)，靈敏度高，診斷迅速，是目前可廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法。

2.3免疫層析技術(shù)

此技術(shù)即免疫膠體金技術(shù)，是把層析技術(shù)和免疫親和作用相結(jié)合的快速檢測(cè)NoV的方法，操作簡(jiǎn)單快速、可靠而應(yīng)用廣泛。該方法是采用抗NoV抗原的單克隆抗體，制成試紙條進(jìn)行檢測(cè)。Tak-anashia S.等[14]首先于檢測(cè)NoV病毒的檢測(cè)，并與RT-PCR法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，它們的一致性為84.1%、靈敏度為69.8%、特異性為93.7%，病毒載量檢測(cè)限為106-107拷貝/g糞便。國(guó)外已有多種商用試劑盒供應(yīng)，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上皆為國(guó)外產(chǎn)品。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

雜交技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），自PCR技術(shù)創(chuàng)建以來(lái)在廣大科學(xué)工作者和檢驗(yàn)人員的努力下，在普通PCR的基礎(chǔ)上改進(jìn)和派生了許多新技術(shù)和新方法。這些衍生的新PCR技術(shù)的靈敏度和特異性得到進(jìn)一步的提高，檢測(cè)范圍得到進(jìn)一步擴(kuò)展，從而在疾病診斷、預(yù)防與控制領(lǐng)域檢驗(yàn)中得到了更廣泛的應(yīng)用[15]。除了能更準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)標(biāo)本中的NoV，尤其是低濃度的NoV感染外，最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行基因型的研究，不會(huì)受到獲得分型單克隆抗體的限制，對(duì)流行病學(xué)研究具有重要意義。

3.1 常規(guī)RT-PCR技術(shù)

劉翼等[16]針對(duì)RNA依賴的RNA聚合酶基因區(qū)采用Koopmans引物JV12Y/JV13I引物JV12Y位于4552 4572bp引物JV13I位于48584878bp擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為327bp建立了RT-PCR技術(shù)。在358份腹瀉患兒糞便中檢出NoV 42份，抽取11份進(jìn)行測(cè)序分析與GenBa-nK進(jìn)行BLASTN庫(kù)比較證明為NoV。

3.2 多重RT-PCR技術(shù)

孫亞萍[17]等應(yīng)用針對(duì)病毒殼體區(qū)域設(shè)計(jì)的4對(duì)引物GⅠ-SKF/GⅠ-SKR、COG2F/G2-SKR、SLV5317/SLV 5749、PreCAP1/82b擴(kuò)增杯狀病毒、星狀病毒殼體區(qū)域的N/S端對(duì)于NoV GGⅠ、GGⅡ、札如病毒、星狀病毒得到的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為330、387、434、719bp分子量差距大可直接通過(guò)瓊脂電泳進(jìn)行鑒定。

3.3 熒光RT-PCR技術(shù)

TaqMan熒光探針為線型寡核苷酸熒光基團(tuán)位于5′端淬滅基團(tuán)位于3′端在退火階段探針雜交于DNA模板Taq聚合酶5′-3′核酸外切酶活性將5′端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái)游離于反應(yīng)體系中從而脫離了3′端淬滅基團(tuán)的作用而釋放熒光。譚翰清[18]等以高保守區(qū)52915376bp作為靶基因、52915310bp為上游引物、53765354bp為下游引物擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為86bp以53195335bp為探針，建立了NoV GGⅠ型TaqMan-MGB探針。Real-time RT-PCR法與以G1-SKF/G2-SKF為引物的常規(guī)RT-PCR相比靈敏度高100倍。司紅麗[19]等以比較保守的NoV GGⅡ型的RNA依賴的RNA多聚酶區(qū)與衣殼蛋白區(qū)的連接區(qū)域?yàn)榘邢驍U(kuò)增區(qū)域50065025bp為上游引物、51085 089bp為下游引物擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為103bp以5048 5070bp為探針建立了NoV GGⅡTaqMan Real-time RT-PCR檢測(cè)法。所建立的方法在102-109拷貝范圍有極好的線性關(guān)系，檢測(cè)體系最低檢出限為102拷貝，而常規(guī)RT-PCR檢測(cè)體系最低檢出限為103拷貝。與輪狀病毒、腺病毒、甲肝病毒無(wú)交叉反應(yīng)。隨機(jī)抽取20個(gè)該法陽(yáng)性樣品將純化PCR產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上進(jìn)行序列測(cè)定結(jié)果全部為GGⅡ型NoV。王毅謙20]等就用Allglo探針同時(shí)檢測(cè)GI和GII型NoV的雙重?zé)晒夥崔D(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的方法，該方法設(shè)計(jì)針對(duì)GI和GII型諾如病毒開放閱讀框架ORFl及ORF2為目的基因的引物和Allglo探針，優(yōu)化最佳反應(yīng)條件，以一步法熒光RT-PCR快速檢測(cè)反應(yīng)體系對(duì)96份臨床糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與單重?zé)晒釸T-PCR方法符合率100%，且測(cè)序結(jié)果顯示目標(biāo)序列正確。證明Allglo探針?lè)z測(cè)GI和GII型NoV技術(shù)特異性好，靈敏度高，可用于感染性腹瀉暴發(fā)中NoV的快速篩查。還有阮佳、許欣[21]等利用逆轉(zhuǎn)錄PCR-毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光快速檢測(cè)法，根據(jù)NoV核酸保守序列選擇引物，擴(kuò)增出特異的PCR產(chǎn)物；采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行毛細(xì)管電泳條件優(yōu)化，以含有DNA熒光染料SYBR Gold的0.5%甲基纖維素為篩分介質(zhì)，通過(guò)激光誘導(dǎo)熒光法檢測(cè)諾如病毒的PCR產(chǎn)物。在優(yōu)化的毛細(xì)管電泳條件下，9 min內(nèi)可完成NoV PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，與基因庫(kù)中NoV的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，一致性達(dá)99%。遷移時(shí)間的日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1%～1.3%和1.8%～2.6%，已用于糞便中NoV的快速檢測(cè)。

3.4 恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）是直接擴(kuò)增RNA來(lái)檢測(cè)NoV，樣品中病原RNA得到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或斑點(diǎn)印跡雜交鑒定結(jié)果。該方法的靈敏度略低于RT-PCR，操作時(shí)間短；假陽(yáng)性率低。呂虹[22]等以恒溫快速檢測(cè)方法進(jìn)行154例北京地區(qū)病毒性腹瀉患者糞便標(biāo)本NoV的檢測(cè)，同時(shí)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）作對(duì)照，評(píng)價(jià)該方法。結(jié)果：在154例病毒性腹瀉的病人標(biāo)本中，采用恒溫快速檢測(cè)方法進(jìn)行NoV檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果61例，陽(yáng)性率為39.6%，RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果54例，陽(yáng)性率為35.1%，以RT-PCR為金標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，檢測(cè)靈敏度90.7%（49/54），特異性88%（88/100）。

3.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是一種大規(guī)模集成的固相雜交技術(shù)，其基本原理是以核酸分子雜交即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)、變性和復(fù)性的原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作為探針，檢測(cè)樣品哪些樣序列及其互補(bǔ)，然后經(jīng)過(guò)一定的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，可定性或定量檢測(cè)，與傳統(tǒng)基因診斷技術(shù)相比，DNA芯片技術(shù)具有微型化、高通量、高度平行性和高速性的特點(diǎn)[23]。陳廣全[24]等將發(fā)表在GeneBank中的NoV、星狀病毒、輪狀病毒、甲肝病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒的全序列和部分序列進(jìn)行比較找到高度保守的核苷酸序列，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)引物和探針芯片在4℃條件下保存7-15個(gè)月性能穩(wěn)定。該芯片在毛蚶中檢出的GGⅡNoV與RT-PCR結(jié)果相對(duì)應(yīng)。史蕾[25]等建立了基于磁珠的可視化基因芯片技術(shù)用于NoV快速檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為提取NoV GGⅡRNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA50ng 20份臨床樣品與RT-PCR比較均為1份GGⅠ、5份GGⅡ陽(yáng)性、14份陰性。

4 食物中NoV的檢測(cè)

RT-PCR檢測(cè)食物中NoV存在樣品病毒量含量低，樣品量大且成分復(fù)雜等問(wèn)題，因此病毒富集濃縮、樣品處理是檢測(cè)的關(guān)鍵，其中有兩個(gè)重要方面影響檢測(cè)結(jié)果，一是樣品中病毒濃縮后的回收率，二是抽提核酸的完整程度和純度。

4.1 病毒濃縮

病毒濃縮NoV濃縮方法一般分為兩大類，一類為有機(jī)絮凝沉淀法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG是具有強(qiáng)烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物，先改變樣品pH值，使毒粒與樣品微粒分開，PEG把病毒沉淀下來(lái)，達(dá)到濃縮的目的。目前對(duì)于固體樣品PEG沉淀法是最有效的濃縮方法。膜過(guò)濾法是另一類有效濃縮病毒的方法，通過(guò)改變膜的pH值使之與帶有電荷的毒粒結(jié)合捕捉病毒，這種方法通常用在濃縮大體積的黏度小、內(nèi)容顆粒小的液體食品或水中。陸建榮[26]等曾用過(guò)這種方法檢測(cè)海水、生活污水中的NoV，為瓶裝水和其他飲料濃縮NV提供了參考。

4.2 核酸提取

食品樣品中所含有的脂肪、蛋白質(zhì)、金屬離子等物質(zhì)都是RT-PCR反應(yīng)抑制因子。NoV是單鏈RNA病毒，核酸提取方法的優(yōu)劣取決于兩個(gè)方面：核酸的質(zhì)量和去除抑制因子的能力。目前應(yīng)用較成熟廣泛的是胍法RNA提取法，即（異）硫氰酸胍-苯酚-氯仿聯(lián)合裂解抽提法，該方法改進(jìn)后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec等產(chǎn)品，與石英砂、磁珠等多孔顆粒相結(jié)合，已結(jié)合了poly（dT）或特異探針的磁珠能較高程度的提純mRNA，去除反應(yīng)抑制因子。石英砂或磁珠純化RNA與傳統(tǒng)的有機(jī)試劑（異丙醇、乙醇）沉淀RNA相比起來(lái)，效果較好，只是成本偏高。廣西鄧麗麗、劉巍[27]等應(yīng)用優(yōu)化甘氨酸緩沖液處理牡蠣勻漿液，當(dāng)PEG沉淀濃度為16%時(shí)的NoV RNA富集提取效果病毒最好，提取后采用熒光定量RT-PCR方法對(duì)牡蠣樣品中的NoV進(jìn)行檢測(cè)，取得了較好的檢測(cè)效果。

5 展望

綜述諾如病毒的檢測(cè)方法，從電鏡法、免疫法到目前應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)法，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。選擇一種適用于自己實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)試劑和方法是廣大檢驗(yàn)工作者面臨的問(wèn)題，電鏡法設(shè)備昂貴不適用日常檢測(cè)之用；ELSIA法簡(jiǎn)便快速、靈敏度和特異性較高較適合基層實(shí)驗(yàn)室使用，只是試劑成本較高，免疫層析法操作使用最為便捷，但是靈敏度還沒法與各類檢測(cè)法相比，且國(guó)內(nèi)還法生產(chǎn)此類產(chǎn)品，使應(yīng)用范圍受到很大限制；條件較好的實(shí)驗(yàn)室傾向使用各類基因檢測(cè)法，它具有高檢測(cè)效率、高靈敏度和用時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，其中Real-time RT-PCR的檢出痕達(dá)102，是其他檢測(cè)方法無(wú)法比較的。只是目前所用的NoV檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)試劑大多是國(guó)外品牌，且價(jià)格較貴，操作技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)環(huán)境、檢測(cè)條件及檢測(cè)人員的技術(shù)水平的要求較為苛刻，還有食品類樣品中NoV的檢測(cè)操作費(fèi)時(shí)繁瑣。因此還有待國(guó)內(nèi)相關(guān)科技人員的努力，盡快開發(fā)出高通量、高靈敏度和高特異和使用簡(jiǎn)便快速的NoV檢測(cè)試劑，為國(guó)內(nèi)市場(chǎng)提供價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的產(chǎn)品，促進(jìn)NoV檢測(cè)的開展，為NoV的防控提供技術(shù)支持。

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作者簡(jiǎn)介：

雷務(wù)年（1970-）男，畢業(yè)于廣西醫(yī)科大學(xué)大專，主管技師，研究方向：主要從事病原微生物檢驗(yàn)。