宋鐵英

【摘 要】目的：研究丙型肝炎患者丙型肝炎病毒（HCV）特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的功能。方法：將表達(dá)丙型肝炎病毒核心蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒通過基因轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并通過篩選獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染Hep-Core細(xì)胞，使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)證實(shí)有HCV核心蛋白表達(dá)；分離患者外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增后得到HCV特異性CTL（HCV-CTL），以Hep-Core細(xì)胞和HepG2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，運(yùn)用乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)HCV-CTL的活性，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中干擾素-γ（IFN-γ）的含量，選擇10例正常人作為對(duì)照組。結(jié)果：丙型肝炎組患者HCV-CTL活性為（24.1±4.6）%，正常對(duì)照組為（43.2±6.1）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。丙型肝炎組患者靶細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的濃度為（961±239）pg/ml，正常對(duì)照組為（3125±676）pg/ml， 兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低，CTL的免疫功能低下與病毒水平和基因型有一定關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】丙型肝炎病毒；特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；功能

【中圖分類號(hào)】R373.2+1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2014）02-0763-01

慢性丙型肝炎是一種具有嚴(yán)重危害性的傳染性疾病[1]。一些報(bào)道表明丙型肝炎患者CTL的免疫功能低下，只能起到抗感染的作用，無(wú)法抵抗感染細(xì)胞中的病毒，導(dǎo)致病毒一直存在于細(xì)胞中，最后可能誘發(fā)肝癌。本文對(duì)18例慢性丙型肝炎患者外周血中丙型肝炎病毒CTL的活性進(jìn)行檢測(cè)，研究了丙型肝炎患者丙型肝炎病毒CTL的功能?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

慢性丙型肝炎患者18例，其中男11例，女7例，年齡25-56歲，平均年齡41.32歲。所有患者均符合丙型肝炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除乙肝和免疫缺陷病感染，且半年內(nèi)沒有接受抗病毒和免疫調(diào)節(jié)治療。使用特異性引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法進(jìn)行丙型肝炎病毒基因型檢測(cè)。此外選擇10例正常人作為對(duì)照，其中男6例，女4例，年齡19-36歲，對(duì)照人員免疫缺陷病毒和肝炎標(biāo)志物檢測(cè)均為陰性，無(wú)飲酒和損肝藥物使用史。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

使用PCR-SSP法對(duì)患者進(jìn)行丙型肝炎病毒基因型檢測(cè)。將表達(dá)丙型肝炎病毒核心蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒通過基因轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep-Core細(xì)胞，經(jīng)過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)證實(shí)有HCV核心蛋白表達(dá)；分離患者外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增獲得HCV特異性CTL（HCV-CTL），以Hep-Core細(xì)胞和HepG2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，運(yùn)用乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)HCV-CTL的活性，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中干擾素-γ（IFN-γ）的含量，以正常人作為對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用采用 SPSS15.0分析軟件包對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中丙型肝炎病毒核心蛋白的表達(dá)

運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)證實(shí)使用HCV-C轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中有HCV核心蛋白表達(dá)，沒有轉(zhuǎn)染或空白的細(xì)胞中無(wú)HCV核心蛋白表達(dá)。

2.2 HCV-CTL活性檢測(cè)

運(yùn)用乳酸脫氫酶法分析18慢性丙型肝炎患者和10例正常人的HCV-CTL活性。丙型肝炎組患者的HCV-CTL活性為（24.1±4.6）%，正常對(duì)照組為（43.2±6.1）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 靶細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN- γ濃度的測(cè)定

丙型肝炎組患者靶細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的濃度為（961±239）pg/ml，正常對(duì)照組為（3125±676）pg/ml， 兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 HCV-CTL活性和獲得SVR的關(guān)系

本研究中另外選取完成常規(guī)抗病毒治療的慢性丙型肝炎患者16例，其中獲得SVR患者9例，無(wú)應(yīng)答患者7例，均經(jīng)過HCV-CTL活性檢測(cè)。其中獲得SVR患者的HCV-CTL活性為（41.5±2.6）%，無(wú)應(yīng)答患者為（25.1±3.5）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

慢性丙型肝炎（CHC）是一種具有嚴(yán)重危害性的傳染性疾病，主要通過血液傳播。CHC的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，丙型肝炎病毒（HCV）和人體免疫系統(tǒng)的相互作用決定了該病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)化。HCV慢性感染可能引發(fā)肝臟慢性炎癥、纖維化等，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致肝癌[2]。丙型肝炎患者CTL免疫功能和肝病的惡化程度有一定的關(guān)系[3]。CTL免疫功能低下包括細(xì)胞抗病毒能力下降、刺激后增殖能力下降、IFN-γ分泌減少等。丙型肝炎病毒感染細(xì)胞后機(jī)體會(huì)產(chǎn)生針對(duì)HCV的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）免疫應(yīng)答，CTL的數(shù)量和質(zhì)量決定了機(jī)體阻止病毒感染惡化和清除病毒感染的效果。如果CTL的免疫應(yīng)答較強(qiáng)，能夠起到完全清除HCV的作用；如果CTL的免疫應(yīng)答功能低下，只能起到抗感染的作用，無(wú)法抵抗感染細(xì)胞中的病毒，導(dǎo)致病毒一直存在于細(xì)胞中，最后可能誘發(fā)肝癌。

本次研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性明顯低于正常人。研究顯示細(xì)胞誘導(dǎo)后CTL培養(yǎng)上清液中IFN-γ濃度的濃度較正常人明顯降低，這也說明慢性丙型肝炎患者CTL細(xì)胞的分泌能力明顯下降，進(jìn)一步導(dǎo)致其免疫功能低下。獲得SVR患者的HCV-CTL活性明顯高于無(wú)應(yīng)答組，可見隨著血液中HCV RNA水平的下降，細(xì)胞中HCV-CTL的活性顯著提高，提示HCV-CTL活性和HCV RNA復(fù)制水平有一定相關(guān)性，CTL細(xì)胞的免疫功能和控制丙型肝炎病毒復(fù)制和清除的基因組有一定關(guān)系。

綜上所述，本次研究表明慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性降低，CTL的免疫功能會(huì)隨之下降。慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低，CTL的免疫功能低下與病毒水平和基因型有一定關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1] 竇曉光，丁洋.慢性丙型肝炎抗病毒治療的新策略和新方法[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2010，08（03）：54-55.

[2] 郭振華，陳青鋒，趙正斌.HCV基因分型與干擾素療效相關(guān)性探討[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2010，13（04）：42-43.

[3] 袁英.慢性丙型肝炎病人唾液及精液中無(wú)丙型肝炎病毒RNA[J].國(guó)外醫(yī)學(xué).內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，2011，09（07）：71-72.