王芳等

【摘 要】目的：觀察芍藥甙對高膽固醇血癥（hypercholesterolemia， HC）家兔離體Oddi 括約肌肌環(huán)收縮活動的影響。方法：純種新西蘭大耳白家兔16只隨機分成兩組：對照組（control， CON）和高膽固醇血癥（hypercholesterolemia， HC）模型組各8只，CON組飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，HC組飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料+膽固醇（cholesterol， Ch），共飼8周。分別取兩組SO制備成離體肌環(huán)，放置于平滑肌恒溫灌流浴槽中，觀察累積濃度芍藥甙對SO肌環(huán)的舒張反應(yīng)。結(jié)果：當(dāng)芍藥甙濃度累積達（100nmol/L、1?mol/L、10?mol/L、100?mol/L）時，對兩組的SO肌環(huán)都產(chǎn)生劑量依賴性舒張作用（P﹤0.01）。但是模型組明顯弱于對照組。結(jié)論：在離體條件下，芍藥甙對正常兔和高膽固醇血癥兔Oddi括約肌肌環(huán)均能產(chǎn)生劑量依賴性舒張作用，但高膽固醇血癥兔Oddi括約肌肌環(huán)舒張性較正常兔下降，具體作用機制有待進一步研究。

【關(guān)鍵詞】芍藥甙；Oddi括約肌肌環(huán)；Oddi括約肌功能障礙；高膽固醇血癥

【文章編號】1004-7484（2014）02-0456-02

近些年來，對SO生理性的認識已日益深入，加快了對SO病理生理條件下動力學(xué)變化的研究。早在1887年意大利生理學(xué)家Oddi發(fā)現(xiàn)SO時就指出，部分患者不明原因的腹痛、發(fā)熱或黃疸可能是SO功能或器質(zhì)性病變引起。經(jīng)過國內(nèi)外近20年的研究，Oddi括約肌運動功能障礙（sphincter of Oddi dysfunction， SOD）不但是大多數(shù)膽系疾病發(fā)病機制的主導(dǎo)環(huán)節(jié)，而且是這些疾患關(guān)鍵的繼發(fā)病理生理改變。在膽道外科手術(shù)中，特別是肝膽結(jié)石的再手術(shù)率很高，復(fù)發(fā)結(jié)石是常見原因之一。通過對SO動力學(xué)改變與術(shù)后結(jié)石復(fù)發(fā)關(guān)系的研究，對膽道結(jié)石或膽管結(jié)石，由于各種原因如炎癥、手術(shù)、高脂餐致使SO的“泵”功能障礙，加之膽囊排空功能損傷，膽汁排出受阻淤滯，膽汁成分改變，在成核因素作用下最終形成結(jié)石。杜凡等[1]發(fā)現(xiàn)高膽固醇使兔的SO基礎(chǔ)壓升高、收縮幅度降低，造影示SO有明顯狹窄，而高膽固醇的持續(xù)存在進一步加大膽囊排空阻力使膽囊運動功能受損。魏經(jīng)國等[2]對高膽固醇血癥誘發(fā)Oddi括約肌功能紊亂實驗研究中發(fā)現(xiàn)，高膽固醇可損害膽管Oddi括約肌的舒張功能，誘發(fā)Oddi括約肌功能紊亂，導(dǎo)致膽管Oddi括約肌排膽阻力增加而致膽囊淤膽。

臨床上對Oddi括約肌功能紊有效的的治療目前是經(jīng)內(nèi)鏡括約肌切開，但是由于是一種有創(chuàng)的治療，易引起胰腺炎的并發(fā)癥，應(yīng)用藥物治療在臨床上取得了一定的療效。芍藥甘草湯是張仲景《傷寒論》的經(jīng)典名方，具有酸甘化陰，緩急止痛的功效，能夠緩解平滑肌痙攣。芍藥甙是中藥芍藥甘草湯中芍藥的有效成分，我們以前的研究證明，芍藥甙能夠?qū)φｎA(yù)處理收縮的兔SO肌環(huán)具有舒張作用。本實驗我們通過制作高膽固醇血癥（HC）兔模型，制備兔SO肌環(huán)，利用灌流法在離體條件下觀察芍藥甙對HC兔SO肌環(huán)收縮活動的作用，探討其對膽道平滑肌的作用及可能的機制。

1 材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗儀器

PZ-1生物張力傳感器（北京微信斯達科技發(fā)展有限公司）

BL-410生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）

TM_WAVE生物信號采集與分析軟件（成都泰盟科技有限公司）

HW-400E恒溫平滑肌槽（成都泰盟科技有限公司）

SMZ 800解剖顯微鏡（Nikon，Japan）

電子天平（型號：FA2004，d：0.1mg）

1ml可調(diào)式移液器。

1.1.2實驗試劑和藥物

芍藥甙（批號TCM068-081221，南京替斯艾么中藥研究所）

EGTA，美國Sigma公司；

氯化乙酰膽堿（Acetylcholine Chloride， Ach），美國Sigma公司；

膽固醇（分析純），上?；瘜W(xué)試劑公司；

二甲基亞砜（DMSO），天津化學(xué)試劑公司；

HEPES緩沖鹽，美國Amresco公司；

NaCl，KCl，NaHCO3，MgCl2，NaH2PO4，葡萄糖（分析純），天津化學(xué)試劑公司。

以下各種液體中成分均以毫摩爾/升（mmol/L）為計量單位。

Krebs-Henseleit（K-H）液（mmoL/L）：NaCl 118.3， KCl 4.7， NaHCO3 25.0， MgSO4 1.2， KH2PO4 1.2， CaCl2 2.5， glucose 11.0， pH=7.4；

1.1.3實驗動物

純種新西蘭大耳白家兔，體重2.5～3.0kg，雌雄不限，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2實驗方法

1.2.1高膽固醇血癥家兔模型的制作

純種新西蘭大耳白家兔16只，2～3個月齡，體重2.5～3.0kg，隨機分為2組，每組8只。對照組（CON）：飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料；實驗組（HC）：飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料+Ch，每日1g，每周6d，停喂1d，共飼8周。高Ch血癥模型判定標(biāo)準(zhǔn)[人類疾病的動物模型1982：120-129]：兔血清總Ch濃度小于3.0mmol/L為正常，大于10mmol/L為達到高Ch血癥標(biāo)準(zhǔn)。分別于喂Ch前、過程中、測試前取靜脈血測量血清總Ch含量。實驗開始前將血清總Ch大于3.0mmol/L兔剔除。

1.2.2 SO肌環(huán)的制備

取家兔，經(jīng)耳緣靜脈注入約10mL空氣處死兔迅速分離SO段，在解剖顯微鏡下小心去除SO周圍脂肪與結(jié)締組織，取其近心段并修剪成橫徑為4mm的肌環(huán)，對角線固定于通氣管和張力換能器之間，置入含10ml K-H液的浴槽中，保持37℃恒溫并持續(xù)通入體積分數(shù)為5%CO2 和95% O2的混合氣體。

1.2.3 SO最適靜息張力的調(diào)節(jié)[3]

將肌環(huán)置于K-H液中溫育，首先給予1.0g初始前負荷，在平衡的過程中，不斷調(diào)節(jié)張力，使其穩(wěn)定在初始前負荷水平，每隔20min更換一次浴槽內(nèi)的K-H液。平衡60min后以60mmol/L的KCl為激動劑，以0.2g為步幅逐步提高前負荷反復(fù)觀察，直至其產(chǎn)生最大收縮力。此時的靜息張力即為最適靜息張力，隨后實驗均在各肌環(huán)最適靜息張力下進行。

1.2.4 芍藥甙對SO肌環(huán)張力的作用

實驗組（n=8）采用累積加藥法，每3min加芍藥甙1次，使灌流液中芍藥甙終濃度分別達10nmol/L，100nmol/L，1?mol/L，10?mol/L，100?mol/L，觀察芍藥甙對SO肌環(huán)的作用；對照組（n=8）以同樣方法累積加藥，每3min加芍藥甙1次，使灌流液中芍藥甙終濃度分別達10nmol/L，100nmol/L，1?mol/L，10?mol/L，100?mol/L，觀察芍藥甙對SO肌環(huán)的作用。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

比較各組給藥前后SO肌環(huán)收縮的程度，計算藥后的收縮幅度與藥前的比值。采用SPSS16.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）表示，兩組間比較采用t檢驗， P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血清總膽固醇濃度

正常兔血清總膽固醇Ch濃度﹤3.0mmol/L，與人血清總Ch濃度正常值近似（2.9～6.0 Ch）。參照復(fù)制兔動脈粥樣硬化模型的方法[4]，本實驗將血清總Ch濃度﹥10.0 mmol/L定為高Ch血癥。各組兔喂Ch前血清總Ch濃度均正常[（1.4±0.8）vs （1.5±0.3） mmol/L， P﹥0.05]，8周后，實驗組兔血清總Ch濃度明顯升高（27.9±1.8）mmol/L，而對照組無明顯變化（1.6±0.5）mmol/L，兩組統(tǒng)計P﹤0.05，差異顯著，實驗組符合高Ch血癥動物模型標(biāo)準(zhǔn)。

2.2兩組肌環(huán)的物理參數(shù)

如表所示，兩組SO肌環(huán)的外徑、長度、重量均無顯著差異。

2.3 芍藥甙對SO肌環(huán)的舒張作用

先用60mmol/L的KCl預(yù)收縮肌環(huán)，等收縮力平穩(wěn)后，加入累積濃度（10nmol/L～100?mol/L）的芍藥甙，記錄不同濃度下肌環(huán)舒張的百分率，由圖看出與對照組相比，HC組SO肌環(huán)對芍藥甙的舒張反應(yīng)在各個濃度點明顯降低。在100nmol/L時，HC組舒張率為19.6%，較對照組降低39%（P<0.01）；1?mol/L時，HC組舒張率為35.7%，較對照組降低41%（P<0.01）；10?mol/L時，HC組舒張率64.3%，較對照組降低24%（P<0.01）；100?mol/L時，HC組舒張率為73.8%，較對照組降低21%（P<0.01）。上述結(jié)果表明HC組對芍藥甙舒張反應(yīng)在上述各個濃度點均明顯較對照組下降（P<0.01）。

3 討論

SO位于膽總管、胰管與十二指腸交界處[5]，十二指腸乳頭周圍，由膽總管末端擴約肌、胰管擴約肌及壺腹括約肌三部分組成，為復(fù)雜肌性結(jié)構(gòu)，富含平滑肌纖維。可分為固有肌和十二指腸延續(xù)肌纖維2類。固有肌有內(nèi)外2層：內(nèi)層主要為縱行肌，外層主要為環(huán)行肌，分別圍繞管周圍[6]。依靠其節(jié)律性收縮與舒張調(diào)節(jié)膽汁與胰液的排除，同時阻止十二指腸內(nèi)容物返流入膽道和胰管，括約肌功能異常可以改變這種節(jié)律性的調(diào)節(jié)作用，誘發(fā)或加重膽胰疾病。SO運動障礙可導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作性膽道樣疼痛。膽囊切除術(shù)后綜合征、慢性反復(fù)發(fā)作性胰腺炎均與SO運動障礙有關(guān)[7-8]。有人認為SO活動異常與膽道結(jié)石有密切關(guān)系[9]，因為基礎(chǔ)壓的升高，逆蠕動增加使膽汁潴留易于形成膽結(jié)石。SO功能異常包括器質(zhì)性和功能性兩大類，前者為括約肌炎癥狹窄和纖維化，后者為SO的動力障礙，其癥狀與胃腸道功能紊亂類似，此時括約肌雖有收縮，但其生理功能已大打折扣。

SOD根據(jù)發(fā)病機制分SO狹窄和SO動力障礙兩大類。狹窄由炎癥、創(chuàng)傷、感染、結(jié)石、瘢痕等因素引起，SO動力障礙為SO的功能性失調(diào)，引起膽管或胰管的間歇性梗阻、括約肌痙攣，影響平滑肌功能可能是動力障礙的一個機制。

高膽固醇飲食已經(jīng)被認為是健康的十大危險因素之一，它可能誘導(dǎo)循環(huán)系統(tǒng)疾病，膽道系統(tǒng)疾病，腎臟疾病，以及多種癌癥。高膽固醇飲食和膽汁淤積之間的關(guān)系已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的重要課題。SO是膽汁流出的唯一通道，因此SO的功能障礙與膽囊膽汁淤積密切相關(guān)。SOD的主要癥狀就是SO的壓力增高以及膽囊體積的增加。臨床資料以及之前的發(fā)現(xiàn)都表明膽汁代謝紊亂可以導(dǎo)致SO的功能障礙，這是由SO持續(xù)性的收縮所導(dǎo)致的一系列的臨床癥狀，包括腹痛及黃疸。

中藥防治膽結(jié)石機理的實驗研究始于20世紀(jì)50年代末，隨著中西醫(yī)結(jié)合治療膽石癥的不斷發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對膽結(jié)石成因研究的不斷深入，中藥防治膽結(jié)石機理的實驗研究水平、技術(shù)也在不斷提高。研究涉及了中藥對膽道系統(tǒng)功能、膽固醇、膽紅素代謝及膽道感染的影響，以及對膽結(jié)石形成具有重要意義的其他領(lǐng)域，初步揭示了中藥防治膽結(jié)石的機理。早期的實驗研究多圍繞藥物的泌膽和排膽效應(yīng)，從膽汁流量、膽囊、膽道括約肌以及十二指腸的運動機能等四個環(huán)節(jié)進行動物實驗，隨著人們對膽汁成分改變在膽結(jié)石形成方面具有重要作用的認識，中藥對高脂血癥的影響一度成為研究熱點，研究水平有了進一步的提高。中醫(yī)認為膽石癥的成因主要與肝膽有關(guān)，肝膽互為表里，同主疏泄，在生理上相互協(xié)調(diào)，在病理上互相影響.膽汁的生成和排泄由肝臟的疏泄功能控制和調(diào)節(jié)。肝氣調(diào)達，疏泄正常，則膽汁排泄暢達；若情志不舒或暴怒傷肝，致使肝氣郁結(jié)，肝失疏泄，導(dǎo)致膽汁排泄不暢，膽汁阻遏郁滯，郁而化熱生火，火灼膽液，為砂石；肝經(jīng)濕熱，肝挾濕內(nèi)擾于膽府，肝膽濕熱互結(jié)，使中精之府濕熱終日彌漫，膽汁渾濁，濕熱薰蒸煎熬膽液日久成石。

中醫(yī)認為[10]，SOD病屬“脅痛”、“黃疸”范疇，辨證證型有肝郁氣滯、胃失和降、濕毒內(nèi)蘊、發(fā)為黃疸型等，其病機為濕熱蘊結(jié)、肝膽疏泄功能失常、脾胃運化不足、血瘀血熱、腑實不通等。國內(nèi)學(xué)者有關(guān)中醫(yī)中藥對平滑肌的舒張進行了大量的研究。尹本如等[11]證實重用大黃可疏通毛細膽管內(nèi)的膽汁瘀積并且增加膽管舒縮功能，降低粘稠度，增加膽流，使膽囊收縮，舒張SO。李紅芳等[12]報道大黃水煎劑可濃度依賴性地降低Oddi括約肌收縮波平均振幅和張力，減慢其節(jié)律性收縮頻率，表現(xiàn)出抑制效應(yīng)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[13]：中藥厚樸中含有一種酚羥基的生物活性物質(zhì)厚樸酚，能抑制細胞外鈣內(nèi)流，顯示鈣通道拮抗劑的特性。大黃素對大鼠和家兔離體回腸具有雙向調(diào)節(jié)作用[14]，可通過增加細胞內(nèi) Ca2+的濃度，促進信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，加強胃腸運動[15]，這種作用對腸麻痹及痙攣可有調(diào)節(jié)治療作用；中藥成方或單味藥的有效成分對改善SOD的作用機制有待進一步觀察和深入。此外， 有實驗發(fā)現(xiàn)[16]，甲基蓮心堿（Nef）對SO和膽道均有與戊脈安相似的阻止外鈣內(nèi)流導(dǎo)致SO松弛的作用，并且發(fā)現(xiàn)Nef對膽道平滑肌的作用不同于血管平滑肌，他不拮抗去氧腎上腺素的收縮作用，為探索藥物治療SOD提供了實驗理論依據(jù)[17-18]?？傊駷橹惯€沒有發(fā)現(xiàn)一種特異性作用于SO的藥物。Wei JG et al.[19-21]已經(jīng)觀察到HC兔SO細胞[Ca2+]i處于過載狀態(tài)?；谝陨险J識，本實驗應(yīng)用芍藥甙對高膽固醇血癥家兔離體Oddi括約肌肌環(huán)張力作用的影響。

本實驗中，我們建立了高膽固醇血癥模型并進行了芍藥甙對Oddi括約肌肌環(huán)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予家兔以高膽固醇飼料喂養(yǎng)后，其血清膽固醇含量明顯升高，表明進食高膽固醇飼料可形成家兔的高膽固醇血癥模型，與文獻報道的較為一致[22]，家兔本身對膽固醇膳食的敏感性較高，對外源性膽固醇吸收率達75%～95%，對高膽固醇血癥清除能力低，易于建立模型。對各實驗組記錄芍藥甙對離體Oddi括約肌肌環(huán)收縮活動的直接作用與對照組比較，給予高膽固醇血癥飼料喂養(yǎng)的模型組，存在SO肌環(huán)的舒張作用，但其作用明顯弱于對照組（P﹤0.01）。

研究表明，芍藥甙對正常純種新西蘭大耳白家兔離體Oddi括約肌肌環(huán)具有劑量依賴性舒張作用，對高膽固醇血癥兔的這種作用依然存在，但是被弱化，說明經(jīng)過高膽固醇飼料喂養(yǎng)后，SO運動功能增強，提高了SO張力，導(dǎo)致SOD [24]，從另一方面說明，SOD后Oddi括約肌舒張功能減弱。

我們以前的研究結(jié)果表明，芍藥甙對SO肌環(huán)的舒張作用是通過多種途徑實現(xiàn)的。芍藥甙可能通過對Kv通道和BKCa通道的調(diào)控，實現(xiàn)了對正常家兔Oddi括約肌肌環(huán)的舒張反應(yīng)；另一條途徑可能與阻斷平滑肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的三磷酸肌醇敏感的鈣離子通道，抑制內(nèi)鈣的釋放有關(guān)。在離體條件下，我們又初步觀察到芍藥甙對高膽固醇血癥兔SO肌環(huán)也具有舒張作用，其作用機制是否與芍藥甙對正常家兔SO肌環(huán)的舒張作用一致？有待進一步研究闡明。

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