高麗霞

摘要 [目的] 對麻栗坡兜蘭ISSR引物進(jìn)行篩選，并建立一個穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、適合麻栗坡兜蘭ISSR反應(yīng)體系。[方法]以麻栗坡兜蘭DNA為模板，分別對Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、DNA等PCR反應(yīng)成分進(jìn)行優(yōu)化，并用優(yōu)化的體系對25條蘭科中報道的ISSR引物進(jìn)行篩選。[結(jié)果]確立了麻栗坡兜蘭最適ISSR-PCR反應(yīng)體系：在25 μl反應(yīng)體系中，Mg2+ 2 mmol/L、引物0.4 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、DNA 1.5 μl、Taq酶1.4 U。利用該體系，共篩選得到10條ISSR引物用于麻栗坡兜蘭分析，并對21份麻栗坡兜蘭材料進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了較好的擴(kuò)增效果。[結(jié)論]該體系穩(wěn)定可靠，為今后ISSR標(biāo)記在兜蘭屬植物的種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性等方面的廣泛應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 麻栗坡兜蘭；ISSR-PCR；體系優(yōu)化

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）20-06553-03

麻栗坡兜蘭（Paphiopedilum malipoense）屬蘭科（Orchidaceae）兜蘭屬（Paphiopedilum）地生蘭或半附生蘭。麻栗坡兜蘭是兜蘭屬現(xiàn)存種類中最原始的類型，代表了由杓蘭屬向兜蘭屬過渡的種類[1]，主要分布于云南東南部、廣西西部、貴州西北部，以及越南北部。一方面由于近年來的過渡采摘，另一方面由于其自身的生物學(xué)原因，它沒有像硬葉兜蘭和杏黃兜蘭那樣延長的地下根狀莖[2]，是當(dāng)前最需要保護(hù)的瀕臨物種之一。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已在蘭科中得以廣泛應(yīng)用。趙謙等[3]用14條ISSR引物分析了14個蝴蝶蘭品種間的遺傳關(guān)系，其多態(tài)百分比為82%，表明蝴蝶蘭品種間存在豐富的遺傳多樣性，并構(gòu)建了ISSR遺傳圖譜；吳振興等[4]用15條ISSR引物對蘭屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析，其多態(tài)百分比為27.2%，并構(gòu)建了ISSR遺傳圖譜；孫小琴等[5]用12條ISSR引物對江西省寒蘭進(jìn)行了遺傳多樣性分析，其多態(tài)百分比為78.9%；馬佳梅等[6]用12條ISSR引物對西雙版納地區(qū)流蘇石斛進(jìn)行遺傳多樣性分析，其多態(tài)百分比為89.74%，表明流蘇石斛品種間存在豐富的遺傳多樣性；嚴(yán)華等[7]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對38種國蘭親緣關(guān)系進(jìn)行分析；沈穎等[8]用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對9種石斛屬植物進(jìn)行品種鑒定分析。但在兜蘭屬的研究中，僅見陳業(yè)等[9]對兜蘭屬親緣關(guān)系的分析，從50條引物中，僅篩選得到6條，對分析遺傳多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

筆者以我國瀕臨物種麻栗坡兜蘭為材料，對影響ISSR擴(kuò)增效果的dNTP、Mg2+、引物、Taq酶以及模板DNA進(jìn)行單因子優(yōu)化試驗，建立適用于麻栗坡兜蘭的ISSRPCR反應(yīng)體系，利用該體系對從蘭科中檢索到的25條ISSR引物進(jìn)行篩選，為進(jìn)一步研究麻栗坡兜蘭遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為麻栗坡兜蘭，采自木論國家級自然保護(hù)區(qū)的自然居群。

1.2 試驗方法

1.2.1

DNA的提取。取新鮮帶葉兜蘭的嫩葉，經(jīng)研磨后，按MURRAY等[10]的CTAB法提取葉片總DNA[10]。

1.2.2

ISSR分析。

ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成，參照高麗等[11]，吳振興等[4]，嚴(yán)華等[7]以及沈穎等[8]的研究結(jié)果選取其中的25條引物進(jìn)行試驗，編號分別為UBC807，UBC811，UBC812，UBC814，UBC817，UBC818，UBC820，UBC822，UBC825，UBC827，UBC829，UBC834，UBC835，UBC836，UBC840，UBC841，UBC855，UBC860，UBC862，UBC864，UBC867，UBC868，UBC880，UBC881，UBC895。

設(shè)定原始反應(yīng)體系為：25 μl反應(yīng)體系中10×PCR Buffer 2.5 μl、dNTP 0.2 mmol/L、Mg2+3 mmol/L、引物0.4 mmol/L、Taq酶1.4 U、模板DNA 30 ng。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，49 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸90 s，40個循環(huán)。最后72 ℃延伸7 min，然后置于4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠，170 V電壓電泳檢測，選取擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物進(jìn)行下一步優(yōu)化試驗。

1.2.3

ISSRPCR試驗設(shè)計。采用單因素試驗設(shè)計方法，對ISSR反應(yīng)體系中的Mg2+、引物、Taq酶、模板DNA、dNTP 5種主要成分進(jìn)行分析（25 μl反應(yīng)體系中各成分優(yōu)化設(shè)計方案見表1）。

1.2.4

引物篩選。取麻栗坡兜蘭DNA樣品用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對25條引物進(jìn)行篩選，選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物。

1.2.5

ISSRPCR體系的驗證。利用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系，用篩選的引物對21份麻栗坡兜蘭進(jìn)行ISSRPCR擴(kuò)增，檢測ISSRPCR擴(kuò)增效率及體系穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 初次引物篩選結(jié)果

將25條引物進(jìn)行初步篩選，引物UBC840擴(kuò)增條帶較理想，因此選擇UBC840進(jìn)行ISSRPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。

2.2 各單因素對擴(kuò)增結(jié)果的影響

2.2.1

引物濃度。由圖1可知，引物濃度在0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L時都有擴(kuò)增，濃度為0.1和0.2 mmol/L時沒有擴(kuò)增條帶。 引物濃度過低時PCR產(chǎn)率會大大降低，甚至不能擴(kuò)增；引物濃度過高時PCR所擴(kuò)增的條帶變得模糊，還會產(chǎn)生新的位點，非特異性擴(kuò)增增加。因此，引物濃度為0.3 mmol/L時擴(kuò)增效果最好。

注：1～8是引物濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L；9～16是dNTP濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mmol/L。

圖1 不同引物濃度、dNTP濃度的ISSRPCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2

dNTP濃度。dNTP是PCR擴(kuò)增反應(yīng)中磷酸基團(tuán)的主要原料，其濃度對PCR反應(yīng)具有至關(guān)重要的影響，對dNTP 8個不同濃度進(jìn)行了擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。由圖1可知，8個濃度均能擴(kuò)增條帶，當(dāng)dNTP濃度為0.15 mmol/L時擴(kuò)增條帶最清晰，效果最好。

2.2.3

Mg2+濃度。Mg2+與dNTP以及模板DNA結(jié)合形成復(fù)合體，才能被Taq酶識別，其濃度影響Taq酶的活性、精度及產(chǎn)物的特異性，還可影響模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，引物二聚體的形成等。由圖2可知，8個不同濃度的Mg2+，除濃度1.0 mmol/L沒有擴(kuò)增條帶外，其他濃度均能擴(kuò)增條帶。濃度為1.5 mmol/L時只有2條擴(kuò)增條帶，濃度高于2.0 mmol/L時，大片段的非特異性擴(kuò)增帶增多，因此確定2.0 mmol/L為Mg2+的最佳濃度。

注：1～8 Mg2+濃度分別為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mmol/L。

圖2 不同Mg2+濃度的ISSRPCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.4

模板DNA。

模板DNA也是影響ISSRPCR反應(yīng)的因素之一，模板DNA的用量分別為10、20、30、40、50、60、70、80 ng，其每個梯度都有擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)DNA用量為30 ng時擴(kuò)增效果較好。

注：1～8是Taq酶用量分別為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2U；9～16是DNA用量分別為10、20、30、40、50、60、70、80 ng。

圖3 不同Taq酶用量、DNA用量的ISSRPCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.5

TaqDNA聚合酶。Taq酶通過降低反應(yīng)的活化能加快反應(yīng)速度，不改變反應(yīng)的平衡點。其用量在PCR反應(yīng)中也是一個重要的因素，用量過低則不能擴(kuò)增，用量過高又會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增且增加成本。試驗設(shè)計了0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 U 8個梯度，擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由圖3可知，在所設(shè)梯度中，擴(kuò)增差異不顯著，因此選0.8 U。

2.3 麻栗坡兜蘭ISSRPCR最佳反應(yīng)體系

最終確定木論麻栗坡兜蘭ISSRPCR的最佳反應(yīng)體系為：25 μl體系中含有引物0.3 mmom/L、dNTP0.15 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、模板DNA 30 ng、Taq酶0.8 U、10×PCR Buffer 2.5 μl。

2.4 引物篩選結(jié)果

按優(yōu)化后的ISSRPCR最佳反應(yīng)體系對引物進(jìn)行篩選，結(jié)果從25條引物中篩選出10條有擴(kuò)增條帶的引物，其中，引物UBC834、UBC835、UBC840擴(kuò)增條帶最清晰，重復(fù)性最好；其次是引物UBC812、UBC822、UBC841、UBC868、UBC880、UBC881；引物UBC855只有微弱的擴(kuò)增（圖4）。

2.5 優(yōu)化體系的驗證

利用優(yōu)化出來的體系和篩選出來的引物用于木論麻栗坡兜蘭ISSRPCR反應(yīng)，驗證該體系的實用性。選取UBC840和隨機(jī)選取21份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖5。由圖5可知，該體系在各材料中具有較清晰的條帶，且具有豐富的多態(tài)性。

3 結(jié)論與討論

DNA模板用量一般對擴(kuò)增結(jié)果影響不大，試驗中，ISSR反應(yīng)對模板DNA的用量要求不是特別嚴(yán)格，每個反應(yīng)梯度都有較好的擴(kuò)增結(jié)果；而適合的引物濃度對PCR產(chǎn)率及多態(tài)性擴(kuò)增都有關(guān)鍵性的影響，該試驗過低的引物濃度（0.1、0.2 mmol/L）沒有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，過高的引物濃度（0.7、0.8 mmol/L）擴(kuò)增產(chǎn)物不清晰，效率低；Mg2+濃度影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率，其濃度對反應(yīng)影響較大，該研究也證明了這一點，當(dāng)濃度低于2 mmol/L時，幾乎沒有擴(kuò)增結(jié)果；相對于反應(yīng)體系中其他成分而言，Taq DNA聚合酶的用量直接決定試驗的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，高濃度Taq DNA聚合酶增加成本和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，低濃度的酶可能使催化能力不夠強而影響產(chǎn)物的合成效率，因此選擇高質(zhì)量的酶是試驗開展的首要任務(wù)，其合適的用量也是關(guān)鍵。

該試驗通過對影響ISSRPCR反應(yīng)的多個因素的系列調(diào)整與優(yōu)化，建立了適合麻栗坡兜蘭ISSR分析的PCR反應(yīng)體系，并將這一體系用于21份木論麻栗坡兜蘭進(jìn)行體系驗證，結(jié)果證明該體系穩(wěn)定可靠，該體系的成功建立為今后ISSR標(biāo)記在兜蘭屬植物的種植鑒定、遺傳多樣性等方面的廣泛應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯 李占東 責(zé)任校對 況玲玲