伍善東等

摘要 [目的]篩選對黃瓜疫病有較好穩(wěn)定防治能力的生防菌。[方法]采用系列稀釋法和平板涂布法對黃瓜疫病菌拮抗細菌進行初步分離，進一步通過平板對峙法對其進行篩選，并通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rDNA序列分析方法對拮抗效果較好的細菌進行了鑒定。[結(jié)果]共分離到黃瓜疫病病原菌的拮抗細菌56株，有4株細菌對黃瓜疫病病原菌顯示出較強的拮抗效果，其中LY38菌株對黃瓜疫病病原菌拮抗帶寬為6.5 mm，抑菌率高達81.2%，通過鑒定可以確定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。[結(jié)論]為黃瓜疫病的田間生物防治提供了參考。

關(guān)鍵詞 黃瓜疫??；拮抗細菌；鑒定；枯草芽孢桿菌

中圖分類號 S436.421.1 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）20-06692-02

Isolation and Identification of Antagonistic Bacteria against Phytophthora melonis

WU Shandong et al （Hunan Provincial Institute of Microbiology，Changsha，Hunan 410009）

Abstract [Objective] The aim was to obtain good antagonistic bacteria against P.melonis. [Method] Some antagonistic bacteria against P. melonis were isolated from soil by using serial dilution method and spreadplate method， further screened on plate. Then efficient antagonistic bacteria against P. melonis were identified by using morphology， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. [Result] Fiftysix bacteria were initially isolated by the serial dilutions and plate coating method and have an antagonistic effect on cucumber blight pathogen. Four of them were further identified by the plate confrontation method and showed strong antagonistic effect on cucumber blight pathogen. LY38 showed the antagonism bandwidth of 6.2 mm on cucumber blight pathogen and the inhibition rate of 81.2%. The LY38 strain was identified as Bacillus subtilis. [Conclusion] The research result provides reference for field biological control of P. melonis.

Key words Phytophthora melonis； antagonistic bacteria；Identification；Bacillus subtilis

黃瓜疫病是一種黃瓜毀滅性土傳病害，由疫霉菌（Phytophthora melonis）侵染所引起[1]，苗期至成株期均可染病，一旦發(fā)病，可造成黃瓜大面積死亡，減產(chǎn)幅度在20%～30%，是影響黃瓜生產(chǎn)的重要因素之一，病菌以28～30 ℃為最適生長溫度。目前，該病的防治以化學(xué)藥劑為主，但由于病菌的抗藥性，防治效果越來越差。在土壤中引進拮抗性微生物防治植物土傳病害的研究已有60多年，并取得一定成果[2]?？股?507是新研制的可防治黃瓜疫病和絲瓜霜霉病等多種病害的藥劑，田間防治效果達到70%～80%[3]。林壁潤等篩選出對黃瓜疫病有拮抗作用的細菌菌株P(guān)78，其搖瓶發(fā)酵液在溫室人工接種條件下防治黃瓜疫病效果平均達95.2%[4]。筆者從土壤中分離并鑒定了對黃瓜疫病有較好穩(wěn)定防治能力的生防菌，以期為黃瓜疫病的田間生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。黃瓜疫病菌由湖南省微生物研究院提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。

PDA培養(yǎng)基：1 000 ml培養(yǎng)基中含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，pH自然。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：1 000 ml培養(yǎng)基中含牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g，pH 7.2～7.4。LB培養(yǎng)基：1 000 ml培養(yǎng)基中含胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母提取物5 g，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 拮抗細菌的分離與純化。

選擇黃瓜疫病發(fā)病田塊，從未發(fā)病植株的根際取土樣，稱10 g土壤直接放入盛有90 ml無菌水（帶玻璃珠）的三角瓶內(nèi)，振蕩10 min。依梯度稀釋至10-8。從10-6、10-7、10-8各吸取稀釋液1 ml，分別加入滅菌培養(yǎng)皿中。每個稀釋濃度3次重復(fù)。待樣品都加入培養(yǎng)皿后，分別注入預(yù)先溶化并冷卻至45 ℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基15～20 ml，使菌懸液和培養(yǎng)基充分均勻混合。將接種好的培養(yǎng)皿倒置放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落移接到試管斜面上。再將分離所得原始菌株劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，按此重復(fù)3次，直至在平板上不再出現(xiàn)異樣菌落時，轉(zhuǎn)移到試管斜面上，4 ℃保存。

1.2.2 拮抗細菌的篩選[5]。

采用平板對峙法。將黃瓜疫病病原菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊，接種在平板中央（菌絲面朝下），28 ℃培養(yǎng)1 d后在距菌絲邊緣2 cm處分別點接4株待測細菌，對照不接菌株，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察有無拮抗帶的出現(xiàn)。

1.2.3 拮抗細菌的代謝物質(zhì)對黃瓜疫病病原菌的抑制作用測定。

將拮抗細菌接入LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，然后將發(fā)酵液在4 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，再經(jīng)細菌過濾器（直徑0.22 μm）過濾，收集濾液。取3 ml濾液與12 ml培養(yǎng)基混合，搖勻制成平板。接種直徑為5 mm的病原菌菌餅于平板中央，同時用無菌水作對照，每處理3次重復(fù)，于28 ℃培養(yǎng)，72 h后測量菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100[6]

1.2.4 拮抗菌株的鑒定。

依據(jù)東秀珠等編著的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]對拮抗細菌進行鑒定。

1.2.5 拮抗菌16S rDNA序列分析。

提取DNA后，對16S rDNA目的片斷PCR進行擴增[8]。引物序列：（F） 5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3；（R）5GGTTACCTTGTTACGACTT3。PCR反應(yīng)體系（50 μl）：去離子水39 μl，PCR buffer 5 μl，dNTP 2 μl，上、下游引物各1 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性50 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收插入PMD18T載體后由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，選擇同源性高的序列使用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜疫病菌拮抗細菌的抑菌作用

從土樣中共分離得到細菌56株，經(jīng)過對峙法篩選共獲得有拮抗效果的菌株4株，其中LX38對黃瓜疫病菌表現(xiàn)出穩(wěn)定的拮抗活性，且生長較快，拮抗帶寬為6.5 mm，抑菌率為81.2%（表1）。選擇LX38做進一步分析研究。

2.2 拮抗細菌LY38的鑒定

2.2.1 LX38菌株的菌落與形態(tài)特征。

LY38菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)36 h后，菌落圓形或不規(guī)則形，表面褐色，較暗，有皺褶。革蘭氏染色呈藍紫色，為革蘭氏陽性菌。菌體桿狀，有鞭毛，油鏡下觀察有橢圓形芽孢。

2.2.2 拮抗茵LX38生理生化特征。LX38生理生化特征見表2。

3 結(jié)論與討論

該試驗從黃瓜根際土壤樣品中分離到具有黃瓜疫病菌拮抗活性的菌株共4株，并對拮抗性最強的LY38進行形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性的分析和16S rDNA序列測定，參照東秀珠等編著的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]，將菌株LY38鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

作物病害的生物防治越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的重視，采用有益細菌防治土傳病害是一條較理想的生物防治途徑。相對而言，生物農(nóng)藥的開發(fā)費用大大低于化學(xué)農(nóng)藥，更由于微生物源農(nóng)藥源于自然，與環(huán)境的相容性高，對人畜較安全，故人們在盡力開發(fā)化學(xué)農(nóng)藥的同時，積極應(yīng)用生物工程技術(shù)，從事微生物源農(nóng)藥的研制開發(fā)[9]?？莶菅挎邨U菌對環(huán)境有很強的抗逆能力，同時對多種植物病原菌有很強的拮抗作用，具有很好的開發(fā)前景。至于枯草芽孢桿菌LY38的抗菌機理及抗菌物質(zhì)組成，尚需進一步研究。

參考文獻

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