木妮熱·依布拉音 尤努斯江·吐拉洪 楊艷梅等

摘要[目的]蕓香草不同極性提取物中多酚含量的測定并研究其體外抗氧化活性。[方法]用70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水等溶劑對云香草進行提取，分別測量其中的多酚含量，并以其中的多酚為基準(zhǔn)，比較分析各提取物的抗氧化活性。[結(jié)果]云香草70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物多酚含量分別為3.87、0.52、0.41、0.83和1.57 mg/g，即提取液極性增大時，多酚含量也相應(yīng)增加；各提取物均有一定的抗氧化活性，所含多酚質(zhì)量濃度相同時，70%乙醇和水提取物的抗氧化活性較大，并與抗壞血酸相近，而氯仿、乙酸乙酯、正丁醇的抗氧化活性較小。[結(jié)論]蕓香草多酚以極性多酚為主，且其抗氧化活性隨多酚極性的增加而加強的趨勢。

關(guān)鍵詞蕓香草；多酚；抗氧化活性；體外；極性提取物

中圖分類號S567；R286；R965文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07738-03

作者簡介木妮熱·依布拉音（1966- ），女，維吾爾族，新疆烏魯木齊人，副主任技師，從事微生物檢驗研究。*通訊作者，副教授，從事天然產(chǎn)物活性成分研究。

收稿日期20140709蕓香草[Cymbopogon distans（Nees et Steud）W.Watson]為禾本科多年生草本植物，又名韭葉蕓香草、諸葛草、臭草，屬多年生草本，有香氣，常生于海拔稍高的石山組破草地，分布于我國新疆、甘肅、陜西、西南及印度、尼泊爾、巴基斯坦等地[1]。蕓香草含有揮發(fā)油、酸性皂甙類物質(zhì)、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、苦味質(zhì)、糖類及酚性物質(zhì)，其精油可直接用作皂用和化妝品用香精，還可以用于殺蟲和消毒劑[2]。全草可做藥材，其味辛、微苦、性溫，民間常用于解表、利濕、止咳平喘，主治風(fēng)寒感冒、傷暑、吐瀉腹痛、小便淋痛、風(fēng)濕痹痛、咳嗽氣喘[3]。對蕓香草的化學(xué)成分和藥用作用研究還處在起步階段，如杜清等利用硅肢柱層析分離純化，鑒定了β谷甾醇、齊墩果酸和尿囊素等3種化合物[4]；薛敦淵等對蕓香草精油化學(xué)成分中鑒定出了松油烯、胡椒酮、十氫-1等26種化學(xué)成分[5]。筆者對蕓香草不同極性提取液體外抗氧化活性進行了初步研究，為蕓香草的認(rèn)識及進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗儀器723型可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司制造）；RE52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）；DXF200植物粉碎機（中山市東鳳鎮(zhèn)安密爾電器廠）；PHB8型筆試PH計（上海佑科儀器儀表有限公司）；SHBⅢ循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2試驗材料蕓香草購自于新疆維吾爾民族醫(yī)院，阿不拉江博士鑒定為蕓香草。用植物粉粹機粉粹成粉末后，陰涼干燥處密閉保存。沒食子酸（≥98%），上海源葉生物科技有限公司；2，2二苯基1苦味酰基自由基（DPPH·）為美國Sigma公司；抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、三氯乙酸等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，F(xiàn)olinciocalten試劑按文獻(xiàn)[6]配制。

1.3試驗方法

1.3.1蕓香草多酚的提取。稱取2份蕓香草樣品各10 g，加70%乙醇200 ml，在50 ℃超聲提取40 min，用三層的中速定性濾紙過濾后，低速離心得濾液，濾渣重復(fù)提取3次，合并濾液，濃縮至50 ml，得粗提取液備用。其中一份粗提取液依此用20 ml的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇恒溫萃取20 min，重復(fù)5次，合并各萃取相，減壓濃縮并定容至50 ml，得氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相樣品溶液。蕓香草不同極性提取物的制備流程如所示。

蕓香草不同極性提取物的制備流程1.3.2蕓香草中多酚含量的測定。

1.3.2.1沒食子酸對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[7]。精確稱取0.075 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，蒸餾水溶解并定容于50 ml容量瓶中，從中移取5.0 ml用蒸餾水至50 ml，得濃度為0.15 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 ml于25 ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至10 ml，各加入Folinciocalten試劑1.0 ml，搖均后再加入20%的Na2CO3溶液2.0 ml，置于50 ℃的水浴10 min，冷卻并定容到25 ml，室溫放置30 min。同時以不加對照品的為空白，在760 nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，得到?jīng)]食子酸含量Y（μg/ml）與吸光度A之間的回歸方程。

1.3.2.2蕓香草不同極性提取液中多酚含量的測定。分別移取蕓香草不同極性溶劑提取液樣品1.0 ml，用蒸餾水稀釋至10 ml ，再取1.0 ml，其余按“1.3.2.1”方法操作，測定體系在波長760 nm處的吸光度，并從沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式中求出蕓香草不同極性提取液中的多酚含量。

1.3.3蕓香草中多酚的抗氧化活性的測定。

1.3.3.1還原力的測定[8]。移取濃度為0.5 mg/ml的蕓香草不同極性提取液0.4 ml，稀釋至1.0 ml，加2.5 ml磷酸鹽緩沖液PBS（0.2 mol/L，pH 6.6）搖均，再加入1%鐵氰化鉀2.5 ml搖均，置于50 ℃水浴恒溫反應(yīng)20 min，加10%三氯乙酸溶液1 ml，搖均，3 000 r/min離心5 min；取上清液2.5 ml，加水2.5 ml稀釋，再加入0.1% 三氯化鐵0.5 ml，避光反應(yīng)10 min后在波長760 nm處測定吸光度。每個樣重復(fù)測定3次，取平均值。同時在相同條件下測定抗壞血酸（VC）的還原力。

1.3.3.2DPPH·自由基清除能力的測定[9]。移取適當(dāng)濃度的蕓香草不同極性提取液各2.0 ml于具塞試管中，加入0.010 mg/ml的DPPH·乙醇溶液2.0 ml，混合均勻，靜置30 min 后倒入1 cm的比色皿中，在517 nm處測定其吸光度值，同時測定樣品空白以及不加樣空白的吸光度值。每個樣重復(fù)測定3次，取平均值。同時相同條件下測定抗壞血酸（VC）對DPPH·自由基清除能力。按下式計算其對DPPH·的清除率，即DPPH·的清除率（%）=1-A-A1A0×100，式中，A0為DPPH與無水乙醇吸光度； A1為樣品與無水乙醇吸光度；A為樣品與DPPH·吸光度。

1.3.3.3羥基自由基清除率的測定[10]。向25 ml容量瓶中依次加入7.5 mmol/ml鄰二氮菲溶液1.0 ml、PBS（pH=7.4）5.0 ml、7.5 mmol/ ml FeSO4溶液1.0 ml，一定量的抗氧化劑溶液（損傷管及未損傷不加提取液）、體積分?jǐn)?shù)為0.1%雙氧水1.0 ml（未損傷管不加），以蒸餾水定容，暗處放置60 min，在510 nm處測定吸光度。以上每加一次試劑需搖均。每個樣重復(fù)測定3次，取平均值。同時以抗壞血酸（VC）作為對照物。羥自由基清除率計算公式為：羥自由基的清除率（%）=A樣品-A損傷A未損-A損傷×100。

1.3.3.4超氧陰離子自由基的清除率的測定[11]。取50 mmol/L 的4.5 ml TrisHCI 緩沖溶液（pH=8.2），4.2 ml 蒸餾水混勻后在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L 鄰苯三酚0.3 ml，迅速搖勻后倒入比測皿，420 nm 下每隔30 s 測定吸光度，總4 min。以10 mmol/L HCI溶液配制空白管作為對照。按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入1.0 ml 蕓香草不同溶劑提取液，蒸餾水減少。同樣以10 mmol/L HCI溶液配制空白管作為對照。同時在相同條件下測定抗壞血酸（VC）對超氧陰離子的清除能力，測定吸光度。超氧陰離子自由基的清除率的測定計算公式為：超氧陰離子自由基的清除率（%）=ΔA1-ΔA2ΔA1×100。

2結(jié)果與分析

2.1沒食子酸對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按“1.3.2.1”項的試驗方法，在760 nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液的吸光度，以沒食子酸含量（μg/ml）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得到食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（），其回歸方程為y=0.009 0x+0.018 3（R2=0.996 3 ）。從可看出，在0～84 μg/ml有良好的線性關(guān)系。

沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線2.2蕓香草不同極性溶劑提取液中多酚含量總多酚含量以FolinCiocalteu法測定，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，所得結(jié)果表明，70%乙醇作為溶劑的粗提取液的多酚含量最多，乙酸乙酯相的多酚含量最小，其順序為70%乙醇（3.87 mg/g）>蒸餾水（1.57 mg/g）>正丁醇（0.83 mg/g）>氯仿（0.52 mg/g）>乙酸乙酯（0.41 mg/g），溶劑極性越強，總酚含量越高。根據(jù)相似相溶原理可知蕓香草多酚以極性酚為主，極性酚含量顯著高于弱極性酚含量。

2.3蕓香草多酚抗氧化活性的研究

2.3.1蕓香草不同極性提取物的還原力。還原力的測定以樣品是否為電子供體為指標(biāo)，供應(yīng)的電子除了可使 Fe3+還原為Fe2+ 外，亦可與自由基反應(yīng)，使自由基成為較穩(wěn)定的物質(zhì)。根據(jù)測得的吸光度值可以測定樣品還原能力的大小[12]。吸光度值越大，表明抗氧化劑對Fe3+還原能力越強。從可以看出，蕓香草不同極性提取物均有一定的還原力，在相同濃度下還原力最大的是抗壞血酸（VC），其次是70%的乙醇提取液，還原力最小的是乙酸乙酯提取液，其還原力相當(dāng)于VC的1/3。

蕓香草不同極性提取物的還原力2.3.2蕓香草不同極性提取物對DPPH·自由基清除能力。DPPH·為一相當(dāng)穩(wěn)定的自由基，其甲醇溶液在517 nm附近有強的吸光值，當(dāng)被抗氧化劑還原，或與另外一個自由基結(jié)合時，吸光值均會降低，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系[13]。在DPPH·溶液中加入自由基清除劑時，溶液顏色變淺，最大吸收峰處的吸光度變小，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關(guān)系。因此，可用自由基的清除情況來評價某物的抗氧化能力。其抗氧化能力用清除率表示，清除率越大，抗氧化能力越強。采用“1.3.3.2”節(jié)的方法測定不同極性蕓香草多酚對 DPPH· 自由基的清除作用，蕓香草不同極性提取物的DPPH·的清除能力結(jié)果表明（），蕓香草不同極性提取液對DPPH·均有一定的清除能力，且均具有明顯的量效關(guān)系。提取物中多酚濃度均為0.100 mg/ml時，70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液和VC等對DPPH·的清除率分別為95.55%、55.91%、80.80%、81.78%、94.15%和99.72%，70%乙醇和水提取液對DPPH·有較強的清除作用，其清除率與VC的相近。

2.3.3蕓香草不同極性提取物對羥基自由基的清除能力。羥自由基（·OH）是一種氧化能力很強的自由基，它能夠很容易地氧化各種有機物和無機物，氧化效率高，反應(yīng)速率快，是造成組織脂質(zhì)過氧化、核酸斷裂、蛋白質(zhì)和多糖分解的活性氧，與機體的衰老、腫瘤、輻射損傷和細(xì)胞吞噬有關(guān)。通過Fenton反應(yīng)所產(chǎn)生的·OH，可使鄰二氮菲—Fe2+水溶液氧化為鄰二氮菲—Fe3+，從而使鄰二氮菲—Fe3+在510 nm處的最大吸收峰消失，據(jù)此可推知系統(tǒng)中·OH的量的變化[14]。采用Fenton法測定了蕓香草不同極性提取液對·OH的清除作用，結(jié)果表明（），各提取液對·OH均有一定的清除作用，它們的多酚濃度相同（0.100 μg/ml）時，各提取液對羥自由基的清除率的大小為VC>水>70%乙醇>正丁醇>氯仿>乙酸乙酯。

蕓香草不同極性提取物對·OH的清除力2.3.4蕓香草不同極性提取物對超氧陰離子自由基的清除能力。鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化釋放氧陰離子自由基（·O-2），并生成有色中間產(chǎn)物，該有色中間產(chǎn)物在420 nm 波長處有一特征吸收峰，當(dāng)有抑制劑存在時，可清除·O-2，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，可通過比色法來檢測有色中間產(chǎn)物的含量，以檢測物質(zhì)清除·O-2的能力[15]。該試驗利用這一特點，測定不同時間反應(yīng)體系的吸光度，測得鄰苯三酚自氧化速率和加入不同極性提取液后鄰苯三酚自氧化速率，間接測定各提取液對·O-2的抑制率。從可以看出，蕓香草不同極性提取液對超氧陰離子有一定的清除能力，各提取液多酚濃度相同（0.100 μg/ml）時，對·O-2清除能力從大到小的順序為70%乙醇>VC>水>正丁醇>氯仿>乙酸乙酯，其中70%乙醇對·O-2清除能力與VC相當(dāng)，而乙酸乙酯提取物對·O-2清除能力是VC的1/4。

蕓香草不同極性提取物對·O-2的清除力安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年3討論

多酚是植物原料的一種重要次生代謝產(chǎn)物，是絕大多數(shù)植物性食品和藥材的活性成分。使用不同極性溶劑可以提取不同極性（即種類）的酚類化合物，它們在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上有所不同。該試驗用70%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水等溶劑超聲提取了蕓香草中多酚，被提取的多酚含量順序為70%乙醇>水>正丁醇>氯仿>乙酸乙酯。溶劑極性越強，總酚含量越高，根據(jù)相似相溶原理可知蕓香草多酚以極性酚為主，極性酚顯著高于弱極性酚含量。蕓香草提取物對DPPH·自由基 、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率和還原力的大小也與溶劑極性密切相關(guān)，總的來說，極性越強的多酚，其抗氧化活性也越強。為了更準(zhǔn)確地表征蕓香草抗氧化作用機理，有必要對提取物中多酚單體組分進行分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。

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