王彩蕊，周國鵬

（北京大學(xué)第一醫(yī)院老年科，北京 100034）

膿毒癥（sepsis）是重癥患者首要的死亡原因之一[1]。每年重癥膿毒癥的發(fā)病率大概為132/100 000，死亡率接近50%[2]。膿毒癥的發(fā)生率與年齡呈正相關(guān)，隨著年齡的增長，其發(fā)病率和死亡率均增加，并且年齡也成為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)[3]。膿毒癥是由感染因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，如果不加以干預(yù)，繼續(xù)發(fā)展可以引起重癥膿毒癥（severe sepsis）及膿毒癥休克（septic shock），最終導(dǎo)致多器官功能障礙。此病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞因子的失控釋放、缺血再灌注、缺氧、免疫失調(diào)、凝血-纖溶紊亂[4]等都起到作用，但是各種因素互相影響，僅以單一的機(jī)制還不能完全解釋。

我國目前已進(jìn)入老齡化社會，老年人的醫(yī)療費(fèi)用支出成為國民經(jīng)濟(jì)的重大負(fù)擔(dān)。由于老年人群的特殊性，比如營養(yǎng)狀態(tài)下降、免疫力下降、基礎(chǔ)疾病增加，患膿毒癥的風(fēng)險也增加。因此改善老年膿毒癥患者的器官功能，對于提高老年人的生存質(zhì)量、減輕國家的醫(yī)療負(fù)擔(dān)極其重要。

膿毒癥誘發(fā)性心肌功能障礙（sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD）是膿毒癥及膿毒癥休克患者常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率可高達(dá)40%～50%，是造成膿毒癥預(yù)后不良的重要原因之一[5]，合并SIMD的膿毒癥患者死亡率可達(dá)70%～90%，而不合并SIMD的膿毒癥患者死亡率僅為20%[5?7]。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是一類配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子核受體家族成員。PPARs有3種異構(gòu)形式，分別是PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。作為轉(zhuǎn)錄因子，PPARs調(diào)節(jié)脂代謝和糖代謝，同時還與細(xì)胞分化和炎癥有關(guān)[8,9]。目前許多研究均顯示PPARα和PPARγ的配體可以減輕休克模型的器官損傷[10,11]，PPARβ/δ在這方面的研究還較少。但有研究顯示，PPARβ/δ的合成配體在動脈粥樣硬化、心肌梗死、急性腎衰竭以及肺炎方面均顯示了抗炎活性[12]。本研究通過制作老齡大鼠膿毒血癥模型，給予PPARβ/δ激動劑GW501516，初步探索PPARβ/δ對老年膿毒癥大鼠心臟功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及模型制備

1.1.1 藥品 PPARβ/δ的配體GW501516購自瑞士Alexis公司，預(yù)溶于二甲基亞砜。

1.1.2 動物及分組 50只SPF級雄性SD大鼠，24月齡，體質(zhì)量為（800±50）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供，所有動物實(shí)驗(yàn)均遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。動物隨機(jī)分為4組：空白對照組（Con組，n＝5）、假手術(shù)組（Sham組，n＝6）、盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）組(CLP組，n＝19）和CLP手術(shù)+GW501516干預(yù)組（CLP＋GW組，n＝20）。

1.1.3 CLP法制作大鼠膿毒癥模型 術(shù)前6h禁食，自由飲水。術(shù)前稱重，予3%戊巴比妥鈉（0.1ml/kg）腹腔麻醉，沿腹中部做長1.0～1.5cm的切口，分離盲腸，4號絲線在盲腸中上部結(jié)扎，用20號針頭在盲腸穿孔1次，并擠出稍許糞便，將盲腸還納，并逐層縫合腹腔。假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔，只做開腹、分離盲腸和縫合的步驟。所有大鼠術(shù)后均在背部皮下注射生理鹽水（37℃，5ml/100g）進(jìn)行液體復(fù)蘇，并將二甲基亞砜或溶于二甲基亞砜的GW501516與生理鹽水共同注射，以便稀釋二甲基亞砜的局部作用。術(shù)后讓其自由飲食，并密切觀察。

1.1.4 GW501516的用量及用法 文獻(xiàn)中報道GW501516的EC50＝1.1nmol/L時，在人體與其他亞型比有1000倍的高選擇性，而EC50＝24nmol/L時，在小鼠體內(nèi)與其他亞型比有500倍的高選擇性[13]。由于沒有提供大鼠的有效劑量，因此我們?nèi)《叩闹形粷舛燃?0nmol/L進(jìn)行計算，進(jìn)而推出GW501516的有效劑量為0.05mg/100g，且預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（結(jié)果未給出）也初步證實(shí)這個劑量是有效的。將GW501516按5g/L的濃度溶于二甲基亞砜中，按10μl/100g的量與生理鹽水混勻后皮下注射，Sham組和CLP組注射相同劑量的二甲基亞砜。

1.2 超聲心動圖對心功能的評價

術(shù)后48h麻醉（3%戊巴比妥鈉0.1ml/kg腹腔注射）后，將大鼠仰臥位放置在超聲檢查臺上，使用Siemens Acuson Sequoia 512超聲系統(tǒng)，Acuson8- 20MHz探頭，經(jīng)大鼠心臟左心室乳頭肌水平行M型超聲檢查。每只大鼠的指標(biāo)均在連續(xù)5個心動周期進(jìn)行測量后取平均值，我們將左心室假想為一個球體并使用超聲后處理系統(tǒng)對圖像進(jìn)行測量計算，測量指標(biāo)包括：心率（heart rate，HR）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic dimension，LVESD）。參照相關(guān)文獻(xiàn)[14]計算評價左室收縮和舒張功能的指標(biāo)。左室舒張末期容積（left ventricular end diastolic volume，LVEDV）＝LVEDD3，左室收縮末期容積（left ventricular end systolic volume，LVESV）＝LVESD3，每搏輸出量（stroke volume，SV）＝LVEDV?LVESV，心指數(shù)（cardiac index，CI）＝（SV×HR）/體表面積（body surface area，BSA），左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）＝（SV/LVEDV）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0對所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s ）表示。多組間的比較采用單因素方差分析（One way-ANOVA），兩兩比較采用Lsd多重比較法，生存曲線比較采用Log-rank（Mantel-Cox）檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GW501516增加CLP術(shù)后老年膿毒癥大鼠的生存率

CLP術(shù)后應(yīng)用液體復(fù)蘇模型能很好地模擬人體膿毒癥的多種微生物感染狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中，老齡大鼠接受CLP手術(shù)后，6h左右即出現(xiàn)死亡，且48h內(nèi)死亡率高達(dá)42.1%，而給予GW501516治療組死亡開始時間延遲至10h左右，且48h內(nèi)總死亡率僅15.0%（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。可見GW501516能明顯地增加老齡膿毒癥大鼠48h內(nèi)的生存率（圖1）。

圖1 生存曲線Figure 1 Survival curve of rats in CLP and CLP+GW groups

2.2 GW501516改善膿毒癥老齡大鼠的心功能

CLP術(shù)后48h應(yīng)用超聲心動圖評價老齡大鼠心功能，結(jié)果見表1。（1）HR和LVEF：CLP組較Sham組HR和LVEF均明顯增加，CLP＋GW組較CLP組HR和LVEF均下降。（2）SV和CI：CLP組與Sham組比較，SV和CI明顯降低，CLP＋GW組較CLP組SV和CI明顯增加。（3）LVEDD和LVEDV：CLP手術(shù)組與Sham組比較，LVEDD和LVEDV均明顯降低，CLP＋GW組較CLP組LVEDD和LVEDV均明顯增加。Con組和Sham組的上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組老齡大鼠心功能指標(biāo)Table 1 Cardiac function indices of aged rats (±s )

表1 各組老齡大鼠心功能指標(biāo)Table 1 Cardiac function indices of aged rats (±s )

Con:control group; Sham:sham operation group; CLP:cecal ligation and puncture group; CLP+GW:CLP+GW501516 (0.05mg/100g) group; HR:heart rate; LVEF:left ventricular ejection fraction; SV:stroke volume; CI:cardiac index; LVEDD:left ventricular end-diastolic diameter; LVEDV:left ventricular end-diastolic volume.Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001; compared with CLP group, #P＜0.05; ##P＜0.01

Group n HR(beat/min) LVEF(%) SV(ml/beat) CI[ml/(min·mm?2)] LVEDD(mm) LVEDV(ml)Con 05 345.48±18.48 0.71±0.08 457.23±58.47 198.43±25.56 08.6±0.63 6.36±0.67 Sham 06 333.67±22.76 0.69±0.13 433.14±130.70 191.81±56.7 8.56±1.14 6.26±1.31 CLP 19 411.16±10.11** 0.93±0.04* 171.47±39.85* 102.05±19.94* 5.65±0.45* 1.75±0.39***CLP+GW 20 318.55±16.65## 0.89±0.04# 470.71±111.6# 185.00±41.21# 8.02±0.66# 5.13±1.09##

3 討 論

膿毒血癥是臨床危重癥患者主要的死亡原因之一，在美國，因膿毒癥住院的患者已經(jīng)超過了心肌梗死。心功能障礙是膿毒癥和膿毒癥休克患者重要的伴隨癥狀。據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，膿毒癥幸存者與非幸存者相比，LVEF值降低，而LVEDV卻增大，提示這是對心功能的一種保護(hù)機(jī)制。LVEF值的降低是可逆的，幸存者7～10d可完全恢復(fù)。膿毒癥導(dǎo)致的心功能不全表現(xiàn)為收縮和舒張功能的聯(lián)合障礙，涉及多方面的機(jī)制，如心臟微循環(huán)的改變、心肌抑制因子、線粒體功能障礙、代謝改變、NO、心肌細(xì)胞凋亡等，而目前較公認(rèn)的機(jī)制是心肌抑制因子和代謝改變。

本實(shí)驗(yàn)中所采用的CLP模型，與臨床膿毒癥相關(guān)性較強(qiáng)[15]，因此能很好地模擬膿毒癥的病理生理變化。實(shí)驗(yàn)中老齡大鼠CLP術(shù)后48h死亡率為42.1%，這與文獻(xiàn)報道的40%～50%的死亡率相符，并且術(shù)后8h左右即出現(xiàn)死亡，而應(yīng)用PPARβ/δ激動劑GW501516液復(fù)蘇后，死亡率下降到15.0%，并且開始出現(xiàn)死亡時間推遲至CLP術(shù)后10h左右，這說明應(yīng)用PPARβ/δ激動劑，能改善膿毒癥大鼠早期生存率，并推遲死亡時間。同時，超聲心動圖顯示，CLP手術(shù)后，老齡大鼠心功能明顯受損，HR增快，SV和CI等反映心臟排血功能的指標(biāo)均明顯下降，LVEDD和LVEDV等反映左室舒張功能的指標(biāo)也明顯下降，提示膿毒癥導(dǎo)致的心功能不全，既有收縮功能又有舒張功能不全，更主要表現(xiàn)為舒張功能的障礙。由于感染、心律失常等因素使膿毒癥患者心率增加，加之心室舒張功能不全，導(dǎo)致左心室充盈受限，雖然這時LVEF增加，左心室過度收縮有部分代償，但心搏儲量較對照組仍然降低，仍然不能滿足機(jī)體的高代謝狀態(tài)，且容易導(dǎo)致心肌的能量缺乏。SV和CI降低，意味著CLP組老齡大鼠心臟功能障礙，不能維持機(jī)體足夠循環(huán)血量，從而容易發(fā)生休克而影響全身重要臟器的能量供應(yīng)。應(yīng)用GW501516復(fù)蘇后，老齡大鼠HR降低，使得心肌耗氧量減少，心室舒張時間相對延長，有利于心室充分充盈。CLP＋GW組的LVEDD和LVEDV均增加，可看成是通過Frank-Starling機(jī)制保持心輸出量的重要的適應(yīng)性改變，并且認(rèn)為這與低死亡率、預(yù)后改善有關(guān)。心室舒張功能的改善有利于維持充足的SV和CI，因此CLP＋GW組較CLP組的SV和CI也增加，這有利于維持膿毒癥大鼠的組織灌注，從而減少休克的發(fā)生，保證重要器官的血液供應(yīng)。有研究顯示幸存者與非幸存者相比，往往有低的LVEF和高的LVEDV，應(yīng)用CLP＋GW組LVEF較對照組降低，提示這也是預(yù)后良好的指標(biāo)[16]。GW501516明顯改善膿毒癥大鼠心臟收縮和舒張功能，降低心率，增加心臟做功效率，這對于改善膿毒癥大鼠的心功能及改善全身循環(huán)狀態(tài)具有重要的意義，也是其降低老齡膿毒癥大鼠死亡率的重要原因。

GW501516為高選擇性PPARβ/δ配體，目前還未應(yīng)用于臨床，但在血脂紊亂、糖尿病和動脈粥樣硬化等代謝相關(guān)疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前的結(jié)果提示GW501516對于改善老齡膿毒癥患者的心功能可能具有重要的意義。PPARβ/δ在大多數(shù)組織器官均有表達(dá)，并且在胚胎早期已經(jīng)出現(xiàn)，目前認(rèn)為這類受體主要參與機(jī)體能量代謝的調(diào)控，而其在炎癥方面的作用也正在引起人們的關(guān)注。推測GW501516降低膿毒癥患者死亡率，改善心功能的作用，主要與其抗炎和調(diào)節(jié)能量代謝的作用有關(guān)，而其具體的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究和探討。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Annane D, Bellissant E, Cavaillon JM. Septic shock[J].Lancet, 2005, 365(9453):63?78.

[2]Dombrovskiy VY, Martin AA, Sunderram J,et al. Rapid increase in hospitalization and mortality rates for severe sepsis in the United States:a trend analysis from 1993 to 2003[J]. Crit Care Med, 2007, 35(5):1244?1250.

[3]Martin GS, Mannino DM, Moss M. The effect of age on the development and outcome of adult sepsis[J]. Crit Care Med, 2006, 34(1):15?21.

[4]Zheng. GJ, Sun. Q, Li YP,et al. Inflammation,endothelium, coagulation in sepsis[J]. Chin Crit Care Med,2009, 21(9):573?576. [鄭貴軍, 孫 茜, 李銀平, 等.炎癥、內(nèi)皮、凝血與膿毒癥[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2009, 21(9):573?576.]

[5]Rudiger A, Singer M. Mechanisms of sepsis-induced cardiac dysfunction[J]. Crit Care Med, 2007, 35(6):1599?1608.

[6]Parrilo JE, Parker MM, Natanson C,et al. Septic shock in humans. Advances in the understanding of pathogenesis,cardiovascular dysfunction, and therapy[J]. Ann Intern Med, 1990, 113(3):227?242.

[7]Vieillard-Baron A, Caille V, Charron C,et al. Actual incidence of global left ventricular hypokinesia in adult septic shock[J]. Crit Care Med, 2008, 36(6):1701?1706.

[8]Duan SZ, Usher MG, Mortensen RM. PPARs:the vasculature, inflammation and hypertension[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2009, 18(2):128?133.

[9]Gervois P, Fruchart JC, Staels B. Drug insight:mechanisms of action and therapeutic applications for agonists of peroxisome proliferator-activated receptors[J].Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 2007, 3(2):145?156.

[10]Di Paola R, Esposito E, Mazzon E,et al. Absence of peroxisome proliferators-activated receptors (PPAR)alpha enhanced the multiple organ failure induced by zymosan[J]. Shock, 2006, 26(5):477?484.

[11]Marzocco S, Di Paola R, Mazzon E,et al. The cyclopentenone prostaglandin 15-deoxydelta (12,14)-prostaglandin J2 attenuates the development of zymosan-induced shock[J]. Intensive Care Med, 2005,31(5):693?700.

[12]Yang X, Kume S, Tanaka Y,et al. GW501516, a PPARδ agonist, ameliorates tubulointerstitial inflammation in proteinuric kidney disease via inhibition of TAK1-NF-κB pathway in mice[J]. PLoS ONE, 2011, 6(9):e25271.

[13]Oliver WR Jr, Shenk JL, Snaith MR,et al.A selective peroxisome proliferator-activated receptor delta agonist promotes reverse cholesterol transport[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(9):5306?5311.

[14]Boluyt MO, Comverso K, Hwang HS,et al.Echocardiographic assessment of age-associated changes in systolic and diastolic function of the female F344 rat heart[J]. J Appl Physiol, 2004, 96(2):822?828.

[15]Zhu XQ, Liu QQ, Yao YM. Research progress of preparation method in sepsis animal modol[J]. Chin Crit Care Med, 2006, 18(2):114?116. [朱雪琦, 劉清泉,姚詠明. 膿毒癥動物模型制備方法的研究進(jìn)展[J]. 中國危重病急救醫(yī)學(xué), 2006, 18(2):114?116.]

[16]Furian T, Aguiar C, Prado K,et al. Ventricular dysfunction and dilation in severe sepsis and septic shock:relation to endothelial function and mortality[J]. J Crit Care, 2012, 27(3):319. e9?e15.