王曉華,胡惠民,馬 強(qiáng),敖強(qiáng)國(guó),程慶礫*

(1解放軍總醫(yī)院南樓臨床部腎臟病科,北京 100853；2第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院腎臟病研究所,上海 200003)

老年人隨著心、腎功能減退,容易出現(xiàn)水鈉潴留,從而使體質(zhì)量顯著增加,心臟容量負(fù)荷加重,出現(xiàn)心肌肥厚、心腔增大等表現(xiàn)。2007年N Eng1 J Med上的一份研究報(bào)告指出,用于治療2型糖尿病的藥物羅格列酮(rosiglitazone)具有潛在的安全性問(wèn)題,長(zhǎng)期使用可大幅增加心臟病風(fēng)險(xiǎn)[1]。本研究通過(guò)使用羅格列酮長(zhǎng)期干預(yù)SD大鼠,觀察到老齡大鼠體質(zhì)量顯著增加,心臟存在心肌肥厚、心腔增大、淤血表現(xiàn),左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)、室間隔厚度(interventricular septal thickness,IVST)異常,提示心臟負(fù)荷增加。而加入保鉀利尿劑阿米洛利(amiloride)的聯(lián)合治療組體質(zhì)量與對(duì)照組相近,且心臟毒副作用較單用羅格列酮組有明顯緩解。為進(jìn)一步觀察羅格列酮致心臟副作用的情況,證實(shí)該聯(lián)合用藥對(duì)羅格列酮心臟副作用的緩解及驗(yàn)證該聯(lián)合用藥的安全性,本研究旨在通過(guò)選取無(wú)腎臟病基礎(chǔ)動(dòng)物模型探索羅格列酮聯(lián)合阿米洛利治療的安全性,指導(dǎo)臨床治療。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購(gòu)自中科院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。SPF級(jí)動(dòng)物由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。馬來(lái)酸羅格列酮、鹽酸阿米洛利由常州善美藥物研究開發(fā)中心有限公司饋贈(zèng),羧甲纖維素(CMC-Na)粉末購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海生化試劑公司。儀器包括全自動(dòng)生化分析儀(日立7080,日本),高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(BECKMAN GS-15R),電熱恒溫烘箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠),病理切片機(jī)(德國(guó)Leica,RM-2135),超聲顯像儀(Vevo 770TM-230,復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院提供)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組 40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、羅格列酮治療組[10mg/(kg·d)]、阿米洛利治療組[5mg/(kg·d)]及羅格列酮聯(lián)合阿米洛利治療組[羅格列酮10mg/(kg·d),阿米洛利5mg/(kg·d)]共4組,每組10只。從第3周斷乳后開始灌胃給藥,給藥時(shí)間6個(gè)月,治療組藥物(混懸于1% CMC-Na)灌胃,對(duì)照組給予1% CMC-Na灌胃,自由進(jìn)水進(jìn)食,每周測(cè)量記錄體質(zhì)量。

1.2.2 生理生化指標(biāo)監(jiān)測(cè) 每周記錄體質(zhì)量,每月眶后取血2ml,常溫下靜置30min,后以4500r/min的速度離心15min,留取血清作肝腎功、血糖、血脂、電解質(zhì)等相關(guān)生化分析。代謝籠收集尿液(禁食,自由進(jìn)水,收集24h尿液),記錄尿量,尿液標(biāo)本經(jīng)過(guò)3000r/min離心10min后留取上清,作尿蛋白定量等尿生化分析。

1.2.3 心臟超聲檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)第6個(gè)月進(jìn)行經(jīng)胸高頻超聲心動(dòng)圖檢查。使用Vevo770TM-230超聲顯像儀,經(jīng)胸壁高頻超聲10S探頭,頻率11.4 MHz,圖像深度2.0cm。10%水合氯醛0.33ml/100g腹腔注射麻醉大鼠,備皮。在二維超聲引導(dǎo)下,M型超聲測(cè)定胸骨旁左心長(zhǎng)軸切面左室腱索水平左室后壁收縮期厚度(left ventricular posterior wall thickness systolic,LVPWTs)和舒張期厚度(left ventricular posterior wall thickness diastolic,LVPWTd),室間隔收縮期厚度(interventricular septal thickness systolic,IVSTs)和舒張期厚度(interventricular septal thickness diastolic,IVSTd)以及左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。Teichholtz公式法計(jì)算左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS),每一測(cè)定值均取3個(gè)連續(xù)完整心動(dòng)周期測(cè)量的平均值。

1.2.4 組織學(xué)分析 第6個(gè)月時(shí)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后,取心、腎、肝稱重(g),計(jì)算心、肝及腎指數(shù),臟器指數(shù)指內(nèi)臟器官質(zhì)量(g)與體質(zhì)量(g)的比值。并取材固定作蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、碘酸雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色及Masson染色。方法及指標(biāo)同第一部分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量及血生化變化

在干預(yù)的6個(gè)月羅格列酮治療組大鼠體質(zhì)量明顯增加,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。羅格列酮聯(lián)合阿米洛利治療組與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各治療組與對(duì)照組SD大鼠比較,生理生化指標(biāo)中血糖、血脂,血清肌酐、尿素氮水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。羅格列酮組出現(xiàn)明顯血鈉偏高,與對(duì)照組有明顯差異(P＜0.05),聯(lián)合用藥組血鈉水平介于羅格列酮組與對(duì)照組之間,阿米洛利組血鈉較低,各治療組血鉀、血鈣差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05；表1)。

2.2 心臟超聲檢查

與對(duì)照組相比,羅格列酮組大鼠的LVPWT,IVST均有明顯增加(P＜0.05)。而LVEF和LVFS并未出現(xiàn)明顯變化(表2)。

表1 6個(gè)月各組大鼠體質(zhì)量及血生化指標(biāo)變化Table 1 Comparison of body mass and biochemical indices among four groups in six months(n＝10,±s)

表1 6個(gè)月各組大鼠體質(zhì)量及血生化指標(biāo)變化Table 1 Comparison of body mass and biochemical indices among four groups in six months(n＝10,±s)

Compared with control group,*P＜0.05

Group Body mass(g)Na+(mmol/L)Glucose(mmol/L)Lipid(mmol/L)Control 664.57±87.79 149.93±1.95 5.83±0.90 0.71±0.19 Amiloride 624.78±70.47 146.09±2.30 5.58±0.84 0.61±0.17 Rosiglitazone 763.24±49.97* 155.61±3.41* 6.10±0.78 0.68±0.19 Combined treatment 643.11±26.23 150.81±5.07 6.05±0.73 0.64±0.19

表2 各組超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of ultrasound cardiogram in four groups(n＝10,%,±s)

表2 各組超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of ultrasound cardiogram in four groups(n＝10,%,±s)

IVSTd:interventricular septal thickness diastolic;IVSTs:interventricular septal thickness systolic;LVPWTd:left ventricular posterior wall diastolic;LVPWTs:left ventricular posterior wall thickness systolic;LVEF:left ventricular ejection fraction;LVFS:left ventricular fractional shortening.Compared with rosiglitazone group,*P＜0.05

Group IVSTd IVSTs LVPWTd LVPWTs LVEF LVFS Control 2.400±0.126* 4.077±0.226* 2.540±0.202* 4.152±0.106* 83.638±11.391 56.455±13.893 Amiloride 2.470±0.179* 3.972±0.347* 2.535±0.152* 4.112±0.444* 81.492±10.442 59.285±15.017 Rosiglitazone 3.100±0.253 5.393±0.364 3.670±0.255 5.080±0.228 76.760±12.943 48.665±11.392 Combined treatment 2.585±0.258* 4.367±0.690* 2.867±0.565* 4.265±0.343* 80.452±11.924 54.070±11.279

2.3 組織學(xué)分析

經(jīng)過(guò)6個(gè)月的藥物干預(yù),羅格列酮治療組與對(duì)照組相比,心臟質(zhì)量/體質(zhì)量明顯增加(P＜0.05),聯(lián)合治療組心臟質(zhì)量/體質(zhì)量相對(duì)羅格列酮組有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05；表3)。

表3 各組大鼠臟器指數(shù)結(jié)果Table 3 Organ indices in four groups(n＝10,±s)

表3 各組大鼠臟器指數(shù)結(jié)果Table 3 Organ indices in four groups(n＝10,±s)

HM:heart mass;BM:body mass;LM:liver mass;KM:kidney mass.Compared with rosiglitazone group,*P＜0.05

Group HM/BM LM/BM KM/BM Control 0.293±0.033* 2.843±0.594 0.308±0.030 Amiloride 0.277±0.032* 2.429±0.643 0.292±0.021 Rosiglitazone 0.344±0.027 2.474±0.617 0.276±0.035 Combined treatment 0.308±0.022* 2.465±0.233 0.301±0.038

HE染色結(jié)果顯示,羅格列酮組心肌組織有受損表現(xiàn),心肌細(xì)胞出現(xiàn)水腫和空泡變性,受累較重的心肌細(xì)胞還可呈小灶狀或片狀壞死,部分肌原纖維溶解,心肌纖維斷裂,部分增粗,心肌細(xì)胞間隙明顯增寬；對(duì)照組肌纖維排列整齊,無(wú)心肌纖維的破壞,細(xì)胞質(zhì)豐富均勻,可見橫紋,細(xì)胞間隙正常,而聯(lián)合用藥組心肌纖維排列整齊,細(xì)胞間隙正常,基本逆轉(zhuǎn)其病理?yè)p害(圖1)。表明羅格列酮有使心肌增厚,心臟增大等作用,阿米洛利能較好抑制這一副作用。

3 討 論

美國(guó)克利夫蘭診所的心臟科專家Nissen博士和統(tǒng)計(jì)學(xué)家Wolski[1]所做的一個(gè)薈萃分析中發(fā)現(xiàn),羅格列酮具有潛在的安全性問(wèn)題,可能大幅增加心臟病風(fēng)險(xiǎn),導(dǎo)致死亡率增加。他們搜集了美國(guó)FDA官方網(wǎng)站和葛蘭素史克公司(Glaxo-Smith Kline,GSK)的相關(guān)臨床研究文獻(xiàn)共116篇,對(duì)符合入選標(biāo)準(zhǔn)(研究時(shí)間＞24周；隨機(jī)的對(duì)照組未使用羅格列酮；結(jié)果包含心肌梗死和心因性死亡發(fā)生率的數(shù)據(jù))的42項(xiàng)臨床試驗(yàn)分析后顯示,與對(duì)照組(12 283例)相比,羅格列酮治療組(15 560例)患者在心肌梗死和心血管原因死亡上的優(yōu)勢(shì)比分別是1.43(95%CI 1.03～1.98,P＝0.03)和1.64(95%CI 0.98～2.74,P＝-0.06),從而得出羅格列酮會(huì)增加心肌梗死和心因性死亡風(fēng)險(xiǎn)的結(jié)論。作者同時(shí)坦言,該研究的局限在于缺乏原始資料數(shù)據(jù)而不能進(jìn)行結(jié)局發(fā)生時(shí)間的分析,但患者和醫(yī)師仍應(yīng)考慮2型糖尿病患者使用羅格列酮所要承受的嚴(yán)重不良心血管事件的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

羅格列酮作為傳統(tǒng)的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxysome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)激動(dòng)劑,除了傳統(tǒng)的代謝調(diào)節(jié)作用外,同時(shí)具有改善高血壓血管對(duì)胰島素的敏感性[2],還能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)分化、抑制多種前炎癥因子基因的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)形成而發(fā)揮抗腫瘤、抗炎和抗纖維化等作用[3]。有很多研究表明,在多種惡性腫瘤組織和很多腎病模型中PPARγ都是高表達(dá)的,而使用PPARγ激動(dòng)劑能夠發(fā)揮有益作用。有相關(guān)研究觀察到噻唑烷二酮類PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮可有效延緩常染色體顯性多囊腎病動(dòng)物模型雄性Han-SPRD雜合子大鼠腎功能進(jìn)展速度,減小腎囊腫,但是存在體液潴留,心臟增大,心功能受限等心臟不良影響[4-6]。本研究選取無(wú)腎臟病基礎(chǔ)但其他生物習(xí)性與Han-SPRD大鼠相似的正常SD大鼠動(dòng)物模型進(jìn)行同等劑量的干預(yù)治療,觀察是否仍存在心臟副作用。結(jié)果顯示,羅格列酮致心臟增大、心肌肥厚、心功能下降的心臟副作用與是否具有糖尿病或腎臟病等基礎(chǔ)疾病基本不相關(guān),在正常的動(dòng)物模型中也可導(dǎo)致。鈉氫交換器(Na+/H+exchanger,NHE)抑制劑阿米洛利主要抑制腎臟遠(yuǎn)端小管和集合管的Na+-K+和Na+-H+交換,從而使Na+和水排出增多,不僅是臨床上良好的保鉀利尿劑,對(duì)心肌細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用[7-9]。NHE抑制劑通過(guò)抑制心肌細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高,從而防止由Na+/Ca2+交換引起的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,在缺血和再灌注時(shí)可防止心肌細(xì)胞損傷、壞死和凋亡。目前研究表明,NHE抑制劑對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用主要表現(xiàn)為：(1)減少心肌梗死范圍；(2)改善再灌注后的心功能；(3)減少心肌缺血和再灌注時(shí)期心律失常的發(fā)生率；(4)維持心肌細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)的平衡；(5)減少心肌細(xì)胞凋亡；(6)保存心肌細(xì)胞能量[4]?；诎⒚茁謇己玫睦蛳[的效果及對(duì)心肌的保護(hù)作用,本研究使用阿米洛利抑制羅格列酮的副作用,觀察到聯(lián)合治療組大鼠心肌肥厚情況較羅格列酮組有明顯緩解,體質(zhì)量及心臟指數(shù)較對(duì)照組無(wú)明顯差異,血鈉及尿鈉水平介于對(duì)照組與羅格列酮組之間,心臟超聲檢查室壁增厚較羅格列酮組有明顯降低,心臟活動(dòng)良好。因此,我們認(rèn)為,阿米洛利對(duì)應(yīng)用羅格列酮的SD大鼠具有心臟保護(hù)作用,一定程度上抑制了其心臟負(fù)荷的增加。其聯(lián)合羅格列酮治療可有效緩解后者的心臟副作用,長(zhǎng)期應(yīng)用安全有效。

圖1 給藥6個(gè)月SD大鼠心肌組織病理學(xué)Figure 1 Histopathological changes of cardiac muscle of SD rats after six months(HE ×400)

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