保 莉,田大成,鄭亞莉

(寧夏人民醫(yī)院腎內科,銀川 750001)

在腎小球硬化(glomerulosclerosis,GS)進展的過程中,足細胞的減少是反映腎小球損傷程度的預測及觀測指標。足細胞特異性分子nephrin及腫瘤蛋白-1(Wilms’ tumor-1,WT-1)的表達變化均會影響足細胞的結構和功能,導致足突融合,足細胞脫落,進而發(fā)生GS[1-4]。

為了系統(tǒng)地觀察足細胞損傷在GS發(fā)展過程中的重要作用,本研究使用的嘌羅霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)腎炎模型,通過觀察其臨床指標、病理形態(tài)及nephrin和WT-1的表達在GS過程中的改變,探討足細胞損傷在GS過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠(寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心),體質量200～220g,隨機分為對照組與PAN組,PAN組大鼠尾靜脈注射PAN(15mg/kg,Sigma公司,美國),尿蛋白陽性即為造模成功。對照組同法注射等量生理鹽水。分別于第4,8天和4,14,20周測定大鼠收縮壓、血脂、血肌酐、血漿白蛋白、24h尿蛋白定量等指標,并于上述時間點處死大鼠,取其腎臟,石蠟包埋,切片。

1.2 過碘酸雪夫染色、腎小球硬化指數及腎小球面積的測定

切片行常規(guī)過碘酸雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色,對每個腎小球進行半定量評分(0～4分)[5],標準如下：0分為正常；0.25分是球囊粘連；0.5分是GS面積占腎小球總面積＜10%；1分表示占10%～25%；2分是占26%～50%；3分是占51%～75%；4分是占76%～100%。腎小球硬化指數(glomerulosclerosis index,GSI)是每一張切片在光學顯微鏡40倍下可見的所有腎小球總分的平均值。GSI＝[(1×nl＋2×n2＋3×n3)/每張腎小球總數]×100%。依照Bertram[6]的方法,PAS染色切片在光鏡下拍照,運用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件自動測定腎小球面積(glomerular area,GA)。

1.3 nephrin和WT-1免疫組化染色及表達的測定

4μm腎組織切片脫蠟至水,檸檬酸鹽抗原修復,過氧化氫室溫孵育,加入兔抗鼠nephrin抗體(1∶100,Abcam公司,美國)及WT-1抗體(1∶100,Santa Cruz公司,美國)孵育(4℃冰箱過夜),PBS沖洗,山羊抗兔IgG室溫孵育,PBS沖洗,按照免疫組化二步法步驟操作(北京中杉金橋生物技術有限公司)。實驗中以PBS代替一抗作為陰性對照。腎小球毛細血管襻外緣觀察到有棕黃色線樣沉積為陽性信號,染色程度評分：0分為陰性,l分為弱陽性(低倍鏡下可疑陽性,高倍鏡下明確陽性),2分為中等陽性(低倍鏡下明確陽性),3分為強陽性(低倍鏡下強陽性)；染色范圍評分：0分指無陽性染區(qū)；1分為1%～25%；2分為26%～50%,3分為5l%～75%,4分為＞75%。將單個腎小球染色程度及范圍的評分相乘得積分值,所有腎小球積分的總和再除以腎小球數量即為nephrin的積分值。WT-1的評分：腎小球內可見深棕褐色細胞核為WT-1的陽性染色,對每個腎小球進行足細胞的計數,進行統(tǒng)計學分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行分析,先進行方差齊性檢驗。計量資料以±s 表示,組間比較采用配對樣本t檢驗。GA與GSI的相關性分析采用二元變量的相關性分析,并求出相關系數r。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PAN注射后各項臨床指標的改變

PAN注射后4周前表現為腎病綜合征,14和20周表現為慢性腎炎及GS的過程。病變隨著時間進展,在14和20周腎小球的損害發(fā)展到廣泛粘連及不同程度的GS或透明樣變性,說明造模成功。

2.2 GA及GSI的關系

PAN組在4周時GA與對照組比較沒有明顯變化,在14周的時候,PAN組的GA明顯大于對照組,在20周時PAN組的GA與正常對照組比較明顯縮小(表1)。PAN組在上述時間點的GSI[(6.21%±0.45%),(25.34%±7.19%),(30.49%±4.37%)]與對照組比較明顯增高(P＜0.01)。將PAN組GA與GSI之間做二元變量的相關分析,20周時r＝-0.82,P＝0.006,呈強負相關關系(圖1)。

表1 PAN組大鼠PAN注射后4,14,20周的GATable 1 The GA at 4,14 and 20 weeks after PAN injection(±s )

表1 PAN組大鼠PAN注射后4,14,20周的GATable 1 The GA at 4,14 and 20 weeks after PAN injection(±s )

GA:glomerular area;PAN:puromycin aminonucleoside.Compared with control group,**P＜0.01,***P＜0.001

Time Group n GA(μm2)4 weeks PAN 85 395.44±5.55 Control 87 381.31±4.94 14 weeks PAN 102 522.36±13.04**Control 98 469.20±8.16 20 weeks PAN 97 438.59±12.11***Control 101 492.69±58.24

圖1 PAN注射后在不同時間點GA及GSI的相關趨勢Figure 1 Correlation trend between GA and GSI in different time points after PAN injection

2.3 nephrin的表達

對照組腎組織中可見nephrin呈淺棕色沿腎小球毛細血管襻呈均勻、線狀分布；4周時PAN組nephrin的表達較對照組有所減少,可見染色變淺,分布不均,部分線性消失。14周時,nephrin的表達進一步減少,新月體及硬化粘連的部分無表達,系膜嚴重增生的區(qū)域nephrin的表達稀疏雜亂。20周時,nephrin在硬化的部位無表達(表2,圖2)。

表2 不同時間點nephrin的表達Table 2 Immunohistochemical semi-quantitative analysis of nephrin expression in different time points(±s )

表2 不同時間點nephrin的表達Table 2 Immunohistochemical semi-quantitative analysis of nephrin expression in different time points(±s )

PAN:puromycin aminonucleoside.Compared with control group,***P＜0.001

Time Group n Nephrin expression 4 weeks PAN 93 08.230±0.875***Control 86 10.230±1.256 14 weeks PAN 72 07.580±0.712***Control 81 09.740±1.234 20 weeks PAN 85 06.080±1.342***Control 79 07.880±0.924

圖2 nephrin在不同時間點的表達Figure 2 Expression of nephrin in different time points(ABC×100)

2.4 WT-1的表達

PAN組在4周時WT-1在足細胞核的表達呈深棕色粗大顆粒,與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；14周時表達較對照組有所減少；20周時減少更加明顯,且染色較弱。足細胞數量在PAN腎病模型中隨著時間的延長依次遞減(表3,圖3)。

表3 不同時間點WT-1的表達與對照組之間的比較Table 3 Expression of WT-1 compared with control group in different time points(±s )

表3 不同時間點WT-1的表達與對照組之間的比較Table 3 Expression of WT-1 compared with control group in different time points(±s )

WT-1:Wilms’ tumor-1,PAN:puromycin aminonucleoside.Compared with control group,***P＜0.001

Time Group n WT-1 expression 4 weeks PAN 56 10.110±1.557***Control 61 10.140±2.022 14 weeks PAN 66 6.800±1.887***Control 64 9.020±1.732 20 weeks PAN 109 4.430±1.007***Control 112 7.340±1.216

圖3 WT-1在不同時間點的表達Figure 3 Expression of WT-1 in different time points(ABC×100)

3 討 論

GS是由多種原因所致的腎小球損傷后出現的共同轉歸[7]。足細胞損傷在GS的過程中起著非常重要的作用。PAN腎炎模型是一個經典的足細胞損害模型[8]。我們的臨床數據顯示,在早期表現為腎病綜合征時,GA沒有明顯改變,說明早期PAN誘導的主要是急性期的腎病綜合征,并表示造模成功。此時出現大量蛋白尿,說明已經存在腎小球濾過屏障一過性的破壞,雖然尿蛋白定量在4周時降至正常,但nephrin的表達已經有所減少,說明存在早期的足細胞損傷。nephrin表達減少所體現的足細胞的損傷程度并沒有引起足細胞從腎小球基膜上脫落,所以WT-1的表達沒有明顯變化,說明雖然存在足細胞的損傷,但足細胞的數量沒有明顯減少。近年來的一些研究也觀察到了這一點,nephrin是腎小球濾過屏障選擇性功能的關鍵,在沒有出現明顯腎臟組織學損害和顯著蛋白尿前,nephrin的表達已經明顯下降[9]。還有研究稱,無論是否有足細胞的脫落,nephrin的異常都會導致蛋白尿[10]。

在14周時,PAN組24h尿蛋白再次明顯增加,雖然沒有第8天時嚴重,但此時呈慢性進行性加重的過程,而GA明顯較對照組增大。此結果可能是在病程進展中,一方面由于腎小球高灌注、高濾過引起了腎臟的代償性肥大；另一方面,GS過程中,部分腎單位破壞,功能喪失,而另一部分殘存腎單位代償性肥大(腎功能代償期)。此時雖然GA由于代償而相對增大,但是由于腎小球部分球囊粘連,毛細血管襻硬化,所以GSI增大,GA與GSI之間存在著一定的正相關關系,但是沒有統(tǒng)計學差異,此時nephrin的表達較前有所減少,說明足細胞的損傷進一步加重,同時,WT-1的表達也明顯減少,說明足細胞數量減少,在切片中已經觀察到硬化的腎小球數目增多。大量研究表明,在GS的發(fā)展過程中,單位腎小球內足細胞數量的減少發(fā)揮著非常重要的作用。Kim等[11]發(fā)現在給大鼠單次注射PAN后,大鼠腎小球的足細胞數量明顯減少,而丟失足細胞的部位會進一步發(fā)生GS。本研究也進一步證實了上述觀點,如能完善電鏡結果將更能在超微結構方面增加足細胞損傷的證據。

PAN模型在20周時表現為慢性腎炎綜合征,在此時GA明顯縮小,GS面積進一步增加,呈不同程度纖維化、透明變性,GS特征明顯。并且GA與GSI之間呈負相關,即GA越小,GS的面積越大、程度越重,GSI越大。說明隨著病程的進展,大面積的GS、纖維化及透明樣變、使得GA縮小,腎功能進行性地發(fā)展到失代償期,最終進入終末期腎病。而此時nephrin在硬化的腎小球幾乎已經沒有表達,而WT-1的表達也呈進行性下降的趨勢,足細胞數量進一步減少,除了影響腎小球濾過膜結構的完整性,還使腎小球基膜大量裸露,與鮑曼囊粘連,加重GS的程度。有研究者在使用PAN模型研究足細胞的損傷中發(fā)現,PAN注射后表達在大鼠腎臟腎小球足細胞足突的NF-кB受體激活劑配體(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)上調,引起足細胞足突的融合,而NF-κB受體激活劑配體(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)顯著抑制PAN誘導的足細胞損傷,表明RANKL/RANK之間的互動在PAN模型中的足細胞損傷發(fā)揮著重要的作用[12,13]。上述研究及本研究均證實了足細胞的損傷與GS之間的密切聯(lián)系。關于足細胞損傷與GS的關系的發(fā)生機制尚未明確,還需要進一步的探索。

4 小 結

(1)成功建立PAN模型,模擬了腎病綜合征及GS的改變過程。(2)在慢性腎炎晚期(20周)GSI和GA之間呈負相關關系,GS程度越重,GA越小。(3)nephrin及WT-1的表達在PAN模型中隨著慢性腎臟病的進展逐漸減少。因此,足細胞損害及數量的減少與GS進展的過程有密切的關系。

【參考文獻】

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