張 欣，姚 粟，劉 洋，劉 勇，張 露，程 池*

（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015）

（G+C）含量是指生物體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）中鳥嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C）占整個(gè)堿基總量[G+C+腺嘌呤（adenine，A）+胸腺嘧啶（thymine，T）]的摩爾分?jǐn)?shù)，即（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)為（G+C）/（G+C+A+T）。（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)是微生物物種的重要遺傳指征，尤其是細(xì)菌，因其（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)范圍較寬，可達(dá)20%～80%[1-3]，且每一種細(xì)菌（G+C）含量變化范圍很小，比較穩(wěn)定，不受菌齡、生長(zhǎng)環(huán)境等因素影響。因此，（G+C）含量分析已成為微生物遺傳學(xué)分類的一種重要方法，在鑒別細(xì)菌種間和種屬間關(guān)系以及建立一個(gè)新的分類單位時(shí)具有重要意義[4-5]。

（G+C）含量測(cè)定方法主要有熱變性溫度法和高效液相色譜法[6-8]。熱變性溫度法是1961年MARMUR J等[8]提出的用于測(cè)定（G+C）含量的一種物理方法，主要基于雙鏈DNA發(fā)生熱變性過程中所呈現(xiàn)的增色效應(yīng)，通過檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm處的吸光度值變化，獲得雙鏈DNA的溶解曲線和解鏈溫度（Tm），再根據(jù)Tm與（G+C）含量的經(jīng)驗(yàn)公式換算得到（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)[9]。Tm間接反映了菌株G-C堿基對(duì)的含量，因?yàn)?個(gè)氫鍵連接的G-C堿基對(duì)斷裂需要的溫度高于兩個(gè)氫鍵連接的A-T堿基對(duì)，因此DNA中G-C堿基對(duì)含量越多，解鏈溫度Tm也就越高[6]。熱變性溫度法得到的DNA（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)由于是物理參數(shù)解鏈溫度通過經(jīng)驗(yàn)公式換算而成，因此間接地反映DNA 的（G+C）含量。

1989年MESBAH M等[7]首次提出利用液相色譜精確測(cè)定DNA的（G+C）含量，DNA經(jīng)過水解（酸解或酶解）處理，再借助色譜分離技術(shù)將水解產(chǎn)物（堿基或脫氧核苷）從色譜柱上逐一分離開，并對(duì)目標(biāo)堿基成分進(jìn)行定量檢測(cè)。近年來隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，定量分析的靈敏度和準(zhǔn)確度大大提高，高效液相色譜法直接定量測(cè)定目標(biāo)堿基，得到的（G+C）含量精確度更高。

此外，通過對(duì)微生物進(jìn)行全基因組測(cè)序，無疑也能從中獲得DNA的（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)，但全基因組測(cè)序費(fèi)用昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，主要用于重要的功能菌株的遺傳學(xué)分析，不適合用于（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)的常規(guī)測(cè)定。

本研究使用熱變性溫度法和液相色譜法對(duì)大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）CICC 10681的（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)進(jìn)行了分析[10]，并首次通過該菌株的全基因組測(cè)序結(jié)果，對(duì)熱變性溫度法和液相色譜法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

參考菌株Escherichia coliK12（CICC 10424）、Escherichia coliDH5α（CICC 10399）；樣品菌株大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）CICC 10681：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)脫氧核苷：鳥嘌呤脫氧核苷（deoxyriboguanosine monophosphat，dGMP）、胸腺嘧啶脫氧核苷（deoxythymidine，dTMP）：生工生物工程有限公司。三乙胺、甲醇（色譜級(jí)）：百靈威科技有限公司；S1核酸酶和小牛小腸堿性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，CIAP）：寶生物（大連）有限公司；其余試劑均使用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

0.1×檸檬酸鈉（saline sodium citrate，SSC）緩沖液的配制：175.3 g NaCl和88.2 g檸檬酸鈉溶于1 L ddH2O，再稀釋200倍，調(diào)節(jié)pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

DU 800核酸蛋白分析儀：美國(guó)Beckman公司；Ultimate 3000 高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；SK8200LHC超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；PTFE HPLC用溶劑過濾器：北京邁瑞達(dá)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌基因組DNA提取

主要按照MARMUR J等[11]的方法提取細(xì)菌基因組DNA，并做了少量改進(jìn)，具體方案如下：

（1）稱取離心收集到的濕菌體1.0 g，重懸于6 mL氯化鈉-Tris-EDTA緩沖液（sodium chloride-tris-EDTA，STE）緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA），振蕩混勻。（2）加入60 μL（100 mg/mL）溶菌酶，10 μL核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）A（12.5 mg/mL）37 ℃水浴2 h。（3）加入660 μL 10%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、80 μL蛋白酶K，50 ℃溫浴2 h。（4）加入1.7 mL5 mol/L NaCl，使終濃度為1 mol/L，充分混勻。（5）用等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1，V/V）混合液反復(fù)抽提至無蛋白分層。（6）取上清，加0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，得到沉淀基因組DNA，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇進(jìn)行脫鹽處理后自然風(fēng)干。（7）用重蒸水或0.1×SSC充分溶解基因組DNA，并用DU800核酸蛋白分析儀測(cè)定檢測(cè)DNA純度。

1.3.2 熱變性溫度法測(cè)定（G+C）含量

提取的基因組DNA溶解于0.1×SSC中，調(diào)節(jié)其濃度為5～15 μg/mL。以大腸桿菌（Escherichia coli）K12為參考菌株，參照LI J等[6]的方法，采用DU 800核酸蛋白分析儀，設(shè)置升溫范圍50～95 ℃，升溫速度1.0 ℃/min，實(shí)時(shí)檢測(cè)升溫過程中DNA樣品在波長(zhǎng)260 nm處的吸光度值，繪制解鏈曲線。通過DU 800軟件分析得到解鏈溫度Tm值，通過公式（G+C）含量=（Tm樣品-Tm參考）×2.08+51.2[2]計(jì)算出菌株基因組DNA的（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)。

1.3.3 高效液相色譜法測(cè)定菌株的堿基組成

以大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α為參考菌株，參照MESBAH M等[7，12]的方法并加以優(yōu)化，主要步驟如下：（1）將提取的基因組DNA溶解于重蒸水中，調(diào)節(jié)其濃度為100～200 μg/mL。（2）取70 μL DNA溶液于1.5 mL離心管中，100 ℃煮沸5 min，立即冰浴。（3）依次添加5 μL乙酸鈉（0.3 mol/L，pH5.1）、5 μL S1核酸酶（1 U/5 μL），37 ℃溫浴2 h。（4）添加10 μL小牛小腸堿性磷酸酶（1 U/10 μL），水解過夜。（5）酶解液于13 000 r/min離心10 min，上清立即轉(zhuǎn)入色譜進(jìn)樣瓶，進(jìn)行高效液相色譜儀分析。優(yōu)化的色譜條件為：采用C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，88%三乙胺和12%甲醇（pH 5.1）作為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量15 μL，色譜分離時(shí)間60 min。

用軟件Chromeleon 7.10 SR1對(duì)色譜圖進(jìn)行分析，獲得DNA酶解液中鳥嘌呤脫氧核苷（dGMP）和胸腺嘧啶脫氧核苷（dTMP）對(duì)應(yīng)的峰面積。（G+C）含量的計(jì)算如下：

式中：Ma0為參考菌株的（G+C）表觀摩爾分?jǐn)?shù)，%；SG0、ST0為參考菌株DNA水解產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離所獲得的dGMP、dTMP的峰面積。

式中：X為校正系數(shù)；M0為參考菌株的實(shí)際摩爾分?jǐn)?shù)；Ma0為參考菌株的（G+C）表觀摩爾分?jǐn)?shù)，%。

式中：Ma為樣品菌株的（G+C）表觀摩爾分?jǐn)?shù)；SG、ST為樣品菌株DNA水解產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離所獲得的dGMP、dTMP的峰面積。

式中：M為樣品菌株的（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)，%；X為校正系數(shù)；Ma為樣品菌株的（G+C）表觀摩爾分?jǐn)?shù)，%。

1.3.4 全基因組測(cè)定

大曲高溫放線菌株CICC10681的全基因組序列測(cè)定由北京諾賽基因組研究中心完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 純度檢測(cè)

充分溶解的菌株基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，DNA條帶清晰，無拖尾。DU80核酸蛋白分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示所有菌株基因組DNA OD260nm/OD280nm＞1.8，OD260nm/OD230nm＞2.0，表明提取的基因組DNA純度較高，無蛋白及小分子鹽等雜質(zhì)污染。

圖1 菌株基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of strain genomic DNA

2.2 熱變性溫度法測(cè)定CICC 10681基因組DNA的（G+C）含量

菌株CICC 10681和參考菌株Escherichia coliK12的熱變性曲線如圖2所示，加熱溫度范圍50～95 ℃，升溫速度1 ℃/min。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)菌株（A）及樣品菌株（B）在0.1×SSC溶液中的熱變性曲線Fig.2 Thermal denaturation curve of standard strains(A) and sample strains(B) in 0.1×SSC solution

DU800軟件分析得到CICC 10681和參考菌株Escherichia coliK12的基因組DNA的Tm值分別為74.4℃和76.4 ℃。根據(jù)公式：（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)=（Tm樣品-Tm參考）×2.08+51.2，計(jì)算得到大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）CICC 10681的（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)=47.0%。

2.3 HPLC 法測(cè)定CICC 10681基因組DNA的（G+C）含量

HPLC得到的菌株脫氧核苷色譜分離結(jié)果見圖3，參照菌株E.coliDH5α和CICC 10681 基因組DNA酶解液的色譜圖中鳥嘌呤脫氧核苷（dGMP）、胸腺嘧啶脫氧核苷（dTMP）分離效果良好，峰形正常，無干擾峰。色譜工作站分析得到大腸桿菌（E.coli）DH5α和大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）CICC 10681基因組DNA的dGMP和dTMP對(duì)應(yīng)的峰面積見表1。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)菌株（A）及樣品菌株（B）DNA的脫氧核苷色譜圖Fig.3 Deoxyribonucleoside chromatogram of DNA instandard strain(A) and sample strain(B)

表1 HPLC分析得出的樣品脫氧核苷成分的保留時(shí)間及峰面積Table 1 Retention time and peak area of sample deoxynucleoside by HPLC analysis

根據(jù)公式，參照菌株大腸桿菌（E.coli）DH5α的表觀摩爾分?jǐn)?shù)Ma0=SG0/（SG0+ST0）=46.021 5%；校正系數(shù)X=M（1-Ma0）/Ma（1-M0）=1.270 639（大腸桿菌（E.coli）DH5α的實(shí)際摩爾分?jǐn)?shù)，M0，=52%）；菌株大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）CICC 10681基因組DNA的（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)為49.3%。

2.4 全基因組測(cè)序分析菌株CICC 10681的（G+C）含量

采用雙端測(cè)序法，用軟件CLC Genomics Workbench 5.0.1 進(jìn)行從頭測(cè)序（De novo sequencing），共得到93個(gè)片段，拼接后總堿基數(shù)為3.46×106個(gè)，（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)為49.0%。

菌株CICC 10681是本課題組從扳倒井高溫大曲曲塊中分離到的一株高溫放線菌，經(jīng)分類學(xué)研究表明其為高溫放線菌屬內(nèi)一新種，定名為大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）[10]。目前，高溫放線菌屬正式公布的有2個(gè)種，普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）和中間型高溫放線菌（Thermoactinomyces intermedius）。據(jù)權(quán)威文獻(xiàn)報(bào)道，這兩個(gè)種模式株的（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)均為48%（HPLC法）[13]，本研究測(cè)得的大曲高溫放線菌CICC 10681的（G+C）含量47.0%（Tm法）、49.3%（HPLC法），與高溫放線菌屬的（G+C）含量接近，符合該屬耐高溫低（G+C）含量的特征。這與其他放線菌屬高（G+C）含量（65%～75%）的特征差異明顯（超過20%），正基于對(duì)（G+C）含量及重組DNA（recombinant DNA，rDNA）序列等遺傳學(xué)分析，高溫放線菌屬的分類學(xué)地位發(fā)生了明顯的改變，從最早的放線菌科轉(zhuǎn)移到新的分類單元高溫放線菌科中[14-15]。

從2種方法的測(cè)定結(jié)果看，Tm法和HPLC法測(cè)定的CICC 10681的（G+C）摩爾含量分別為47.0%（Tm法）和49.3%（HPLC法），與該菌株的全基因組測(cè)序結(jié)果（49.0%）相比，Tm法的結(jié)果存在一定的偏差。主要原因可能有：（1）Tm法得到的（G+C）含量是通過Tm值與（G+C）含量的經(jīng)驗(yàn)公式得到，這種換算關(guān)系因DNA緩沖體系的濃度、pH的不同，差異顯著。（2）DNA純度不高或發(fā)生輕微降解，尤其是核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）的污染直接對(duì)結(jié)果產(chǎn)生偏差。另外，Tm法忽略了4種堿基之外的其他稀有堿基，且在Tm值較低或較高時(shí)，儀器精密度對(duì)結(jié)果的影響比較明顯。因此，Tm法對(duì)試劑的準(zhǔn)確配制、DNA的純度和儀器的要求比較高。而HPLC法直接定量檢測(cè)DNA的堿基組分，排除了稀有堿基、修飾堿基和RNA的干擾，色譜靈敏度高于分光光度法，測(cè)得的結(jié)果與全基因組測(cè)序的結(jié)果非常接近。而且HPLC法能實(shí)現(xiàn)大量樣品的連續(xù)化處理，測(cè)定效率高。因此，HPLC法更適合用于微生物DNA（G+C）含量的準(zhǔn)確描述和大量樣品的測(cè)定。

3 結(jié)論

對(duì)大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）CICC 10681的分析表明，Tm法和HPLC法測(cè)定的（G+C）摩爾分?jǐn)?shù)分別為47.0%（Tm法）和49.3%（HPLC法），與全基因組測(cè)序的結(jié)果（49.0%）基本一致，符合高溫放線菌屬的低（G+C）含量特征。HPLC法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于微生物分類學(xué)中對(duì)微生物（G+C）含量的準(zhǔn)確描述。

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