馮一峰，王 艷，唐 都，李湘鈺，吳翠云，2*

（1.塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

植物中葉綠素（chlorophyll）含量是調(diào)查植物生理生化及生態(tài)指標(biāo)的一個重要測量參數(shù)，其不僅能表達(dá)植物生長發(fā)育情況，也能作為檢測周圍環(huán)境因子的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。葉片是植物光合作用的主要器官，葉片的大小與植物光合產(chǎn)物的積累直接相關(guān)[2]，植物體中葉綠素含量多少能體現(xiàn)出其光合能力的強(qiáng)弱，因此葉綠素含量的測定方法也變得尤為重要。

目前葉綠素含量的測定方法主要有2種，一種是分光光度法，另一種是SPAD葉綠素儀法[3]，前者是對葉片葉綠素的精確測量，適用于實驗室測量，后者比較粗放，適于田間測量。分光光度法測量已在桑葉、茶葉、櫻桃、紅香椿[4]、杉木[5-8]等較多的植物上有運用，不同植物葉片的葉綠素含量有所差異，相同植物不同提取方法對葉綠素含量測量也有很大影響[9]。張宇斌等[10]認(rèn)為乙醇∶丙酮（1∶1）的混合液提取葉綠素含量最高，張素霞等[11-12]研究認(rèn)為乙醇-丙酮2∶1混合浸提10 min效果最好，李得孝等[13]研究認(rèn)為室溫下丙酮-乙醇水混合浸提效果最好，王冬等[14]以乙醇與丙酮物質(zhì)的量之比1∶1的混合溶液為浸提劑對仙人掌進(jìn)行葉綠素提取得出：溫度50 ℃，固液比為1∶40條件下提取5 h，葉綠素的提取效率最高。本研究在前人研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討駿棗葉片葉綠素含量測定的優(yōu)選方法：將不同植物葉綠素的提取效果較好的方法進(jìn)行綜合與比較（3種提取液：體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)80%丙酮、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇-體積分?jǐn)?shù)80%丙酮1∶1混合、4種提取方法：室溫靜置浸提法、室溫研磨浸提法、研磨+室溫靜置浸提法、溫?zé)犰o置浸提法），以期選出適合紅棗葉片葉綠素的較好提取液及提取方法，為今后棗葉片中葉綠素的提取測定方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駿棗葉片：新疆阿克蘇地區(qū)；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇：天津永晟精細(xì)化工有限公司；丙酮：西安化學(xué)試劑廠；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；H2100R高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 試驗方法

九月下旬取樣，取駿棗相同二次枝上同一節(jié)棗吊中部葉片裝入采集箱立即帶回實驗室擦凈、去除葉脈剪碎（不超過2 mm）混勻，一部分現(xiàn)用，另一部分放入-20 ℃冰箱待用，每個指標(biāo)做3次重復(fù)。

1.3.1 室溫靜置浸提法

取3支25 mL試管分別放入0.2 g剪碎的駿棗葉片，再向3支試管中分別加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)80%丙酮、乙醇-丙酮1∶1混合液各10 mL，黑暗處室溫（25 ℃）浸提24 h，其間不停搖勻，24 h后葉片變白，于663 nm和646 nm波長下比色。

1.3.2 室溫研磨浸提法——室溫下研磨后立即離心比色

分別稱取0.2 g剪碎的葉片于3個研缽，加入2.5 mL研磨液（3個研缽研液分別為體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)80%丙酮、乙醇-丙酮混合液）于室溫條件下研磨5 min至葉片顏色變白后倒入離心管，洗滌研缽3次，每次2.5 mL，共10 mL研液，重復(fù)3次后立即離心比色，離心前攪拌均勻。

1.3.3 研磨+室溫靜置浸提法

如1.3.2方法黑暗處室溫放置2 h，其間不停攪拌，葉片變白后離心比色。

1.3.4 溫?zé)犰o置浸提法

取3支25 mL試管分別放入0.2 g剪碎的駿棗葉片，再分別加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)80%丙酮、乙醇-丙酮1∶1混合液各10 mL，在50 ℃條件下浸提5 h，其間不停搖勻，避光，葉片變白后離心比色。

1.3.5 實驗測定方法

采用UV1800型紫外/可見光分光光度計進(jìn)行比色，本試驗中3種浸提液的吸收光譜基本相似[4]，計算公式可以采用的Arnon法修正公式進(jìn)行計算，數(shù)據(jù)用Excel和DPS軟件進(jìn)行處理分析。葉綠素計算公式如下：

葉綠素總含量（mg/g）=葉綠素a含量+葉綠素b含量

式中：A為分光光度計所測吸光度值；V為樣品提取液總體積，mL；W為駿棗葉片鮮質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一種提取液不同提取方法的比較結(jié)果

2.1.1 乙醇為提取液4種提取方法對駿棗葉綠素提取量的影響

以乙醇為提取液的4種提取方法測得的駿棗葉片中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量差異見圖1。由圖1可以看出，室溫靜置24 h提取的各種葉綠素含量與研磨+室溫靜置浸提法無顯著差異，但顯著高于室溫研磨提取法和溫?zé)犰o置提取法，其中，葉綠素a提取量分別提高61.18%和90.28%，葉綠素b提取量分別提高76.19%和68.18%，總?cè)~綠素提取量分別提高64.15%和85.11%；研磨+室溫靜置提取法的葉綠素a和總?cè)~綠素均顯著高于室溫研磨提取和溫?zé)犰o置提取，其中，葉綠素a提取量分別高出80%和113%，總?cè)~綠素提取量分別高出72.64%和94.68%，而葉綠素b提取量無顯著差異；室溫研磨提取和溫?zé)犰o置提取在各葉綠素之間均無顯著差異；同樣是研磨法中的研磨+靜置室溫提取和室溫研磨提取之間差異性顯著，原因是后者的提取時間不夠充分導(dǎo)致提取葉綠素的量不足。

圖1 體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取液不同提取方法對葉綠素含量提取效果的影響Fig.1 Effect of different extraction methods by 95% ethanol extract on chlorophyll extraction content

2.1.2 丙酮為提取液4種提取方法對駿棗葉綠素提取量的影響

由圖2可以看出，以體積分?jǐn)?shù)80%丙酮為提取液進(jìn)行提?。禾崛∪~綠素a時，4種提取方法之間均存在顯著差異，表現(xiàn)為室溫靜置提取＞研磨+室溫靜置提?。緶?zé)犰o置提?。狙心ナ覝靥崛?；對葉綠素b的提取中，室溫靜置提取法顯著高于其他3種提取方法，研磨+室溫靜置提取顯著高于室溫研磨提取和溫?zé)犰o置提取，室溫研磨提取與溫?zé)犰o置提取之間無顯著差異；提取總?cè)~綠素時，4種提取方法之間也均存在顯著差異，總?cè)~綠素以室溫靜置的提取效果較好，達(dá)到1.58 mg/g，顯著高于其他3種提取方法，室溫研磨提取的提取效果較差，只有0.36 mg/g，顯著低于其余3種提取方法，較少的提取量是由于研磨過程中提取的時間太短，葉綠素還未充分提出且葉綠素在研磨過程中分解較快導(dǎo)致的，與徐芬芬等[15]對小白菜葉綠素含量的測定研究結(jié)果一致。

圖2 體積分?jǐn)?shù)80%丙酮提取液不同提取方法對葉綠素含量提取效果的影響Fig.2 Effect of different extraction methods by 80% acetone extract on chlorophyll extraction content

2.1.3 乙醇-丙酮1∶1混合提取液4種提取方法對駿棗葉綠素提取量的影響

圖3 混合提取液不同提取方法對葉綠素含量提取效果的影響Fig.3 Effect of different extraction methods by mixed extract on chlorophyll extraction content

由圖3可以看出，混合提取液對葉綠素a的提取量變化趨勢與2.1.1中的單一乙醇提取液提取量變化趨勢相同，室溫靜置提取與研磨+室溫靜置提取效果之間差異不顯著，室溫研磨提取與溫?zé)犰o置提取效果之間差異不顯著，前兩種提取方法提取效果顯著高于后兩者提取方法；混合提取液對葉綠素b的提取效果與其對葉綠素a的提取效果變化趨勢相同；混合提取液中研磨+室溫靜置提取總?cè)~綠素的提取效果顯著高于其他3種提取方法的提取效果，達(dá)到了1.78 mg/g，室溫靜置提取效果其次，室溫研磨提取和冷凍材料溫?zé)犰o置提取效果處于同一水平，分別為0.82 mg/g和0.86 mg/g，提取總?cè)~綠素的效果較差。

2.2 4種提取方法分別與不同提取液的交互作用提取效果比較

同種處理方法下不同浸提液的提取效果比較，對4種提取方法提取的葉綠素做顯著性差異分析，結(jié)果見表1。由表1可以看出，室溫靜置法對葉綠素a和葉綠素b的提取量總體高于其他各提取方法的提取量，且與室溫研磨提取和溫?zé)犰o置提取存在顯著性差異；眾多提取方法中，95%vol乙醇室溫靜置提取（1.74 mg/g）、95%vol乙醇研磨+室溫靜置提?。?.83 mg/g）和乙醇-丙酮1∶1混合液研磨+室溫靜置提取（1.78 mg/g）提取效果較好，顯著高于其他各處理；80%vol丙酮室溫研磨提取效果較其他各處理差，可能由于時間太短，葉綠素提取不夠充分，也可能是丙酮極易揮發(fā)，提取液量迅速減少而影響提取效果。

表1 處理方法與浸提液的交互作用Table 1 Processing method and interaction of the extraction solution

3 結(jié)論

4種不同的提取方法中，單種提取液體積分?jǐn)?shù)95%乙醇對駿棗葉片總?cè)~綠素的提取效果均較好，顯著高于單種提取液丙酮，與李志丹等[16]研究結(jié)果一致。在研磨法和浸提法3種浸提液浸提效果中，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇作為研磨劑研磨后黑暗中放置2 h浸提效果較好，體積分?jǐn)?shù)80%丙酮研磨后立即離心比色效果較差，乙醇提取液室溫下浸提24 h、乙醇-丙酮1∶1混合液研磨+靜置室溫提取效果雖與乙醇研磨后黑暗中放置2 h的葉綠素提取量無顯著性差異，但乙醇室溫24 h耗費時間，混合液中的丙酮為有毒氣體，因此選用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇研磨后黑暗中放置2 h（其間不停攪拌）進(jìn)行紅棗葉綠素的提取。

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