付振宇張 鴿黃玉華嚴(yán)春寅

俞 江3孫利國1陳永昌1繆 瑜1**張 杰1

1.揚(yáng)州大學(xué)第五臨床學(xué)院暨常熟市第二人民醫(yī)院泌尿外科（常熟 215500）;

2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科; 3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院泌尿外科

siRNA沉默HIF-lα基因?qū)η傲邢侔㏄C3細(xì)胞生長增殖及凋亡的影響*

付振宇1張 鴿1黃玉華2**嚴(yán)春寅2

俞 江3孫利國1陳永昌1繆 瑜1**張 杰1

1.揚(yáng)州大學(xué)第五臨床學(xué)院暨常熟市第二人民醫(yī)院泌尿外科（常熟 215500）;

2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科; 3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院泌尿外科

目的探討沉默缺氧誘導(dǎo)因子-lα（hypoxia inducible factor-lα，HIF-lα）基因?qū)η傲邢侔㏄C3細(xì)胞生長增殖及細(xì)胞凋亡的影響。方法實(shí)驗(yàn)分為PC3組（空白對照組）、PC3+NC siRNA組（陰性對照組）和PC3+HIF-lαsiRNA組（干擾組）。使用經(jīng)過篩選證實(shí)有效的HIF-lα-siRNA序列和陰性對照NC-siRNA序列，經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞。采用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后96h內(nèi)各組細(xì)胞的生長增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后48h各組細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果PC3+HIF-lαsiRNA組腫瘤抑制率高于PC3+NC siRNA組，尤以轉(zhuǎn)染后第48h表現(xiàn)得較為明顯；在第48h，PC3+HIF-lαsiRNA組細(xì)胞存活率明顯低于PC3組和PC3+NCsiRNA組（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染后第48h，干擾組細(xì)胞凋亡率為（11.2±1.13）%，PC3組和PC3+NC siRNA組細(xì)胞凋亡率分別為（2.4±0.26）%和（2.5± 0.36）%，干擾組細(xì)胞凋亡率顯著高于兩對照組（P＜0.01）。結(jié)論 沉默HIF-lα基因能抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

微RNAs; 前列腺腫瘤; 細(xì)胞系, 腫瘤; 缺氧誘導(dǎo)因子1, α亞基; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞凋亡

實(shí)體腫瘤增大到約1～2mm3時(shí)，內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)乏氧的微環(huán)境，此時(shí)惡性腫瘤細(xì)胞將產(chǎn)生一系列生物學(xué)行為的變化來適應(yīng)低氧狀態(tài)。缺氧誘導(dǎo)因子-lα（hypoxia inducible factor-lα，HIF-lα）通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞能量代謝、生長凋亡、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境，促使腫瘤進(jìn)展。HIF-lα在這些過程中起著中心介導(dǎo)作用[1]，降低HIF-lα的表達(dá)可能有抗腫瘤的作用。本研究通過小干擾RNA（siRNA）沉默前列腺癌PC3細(xì)胞HIF-lα基因，檢測細(xì)胞增長、凋亡的變化，觀察沉默HIF-lα基因?qū)C3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

材料與方法

一、材料

前列腺癌PC3細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物研究所；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司；凋亡試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。根據(jù)HIF-1α（GenBank Accession Number：NM_001530）基因信息，使用siRNA序列設(shè)計(jì)軟件，選擇了針對目的基因的siRNA序列及陰性對照序列NC，并設(shè)計(jì)其互補(bǔ)的模板單鏈，額外設(shè)計(jì)了TT或dTdT懸掛末端，以增加siRNA的穩(wěn)定性。人HIF-1α序列特異性的siRNA與人EST數(shù)據(jù)庫做BLAST序列比對，確認(rèn)與其他基因無結(jié)合位點(diǎn)；陰性對照序列與哺乳動(dòng)物無同源性，siRNA委托上海吉瑪生物科技有限公司合成。HIF-lαsiRNA、陰性對照NC-siRNA及熒光標(biāo)記的FAM-NC-siRNA的設(shè)計(jì)、篩選、驗(yàn)證等均在蘇州大學(xué)免疫研究所進(jìn)行。篩選出的有效HIF-lα-siRNA靶向HIF-lα mRNA的位點(diǎn)為792-812，正義鏈為5’-GUGAUGAA AGAAUUACCGAAUTT-3’， 前列腺癌PC3細(xì)胞被HIF-lα-siRNA靶向干擾后48h在mRNA水平的抑制率為71%，在蛋白水平的抑制率為70.27%。NC- siRNA片段正義鏈序列為5’- UUCUCCGAACGUGUCACG UdTdT-3’。

二、方法

（一）實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)分PC3組（空白對照組）、PC3+NCsiRNA組（陰性對照組）及PC3+HIF-lαsiRNA組（干擾組）。PC3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于10%胎牛血清（FBS）的MEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3d 1:2傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染時(shí)將PC3細(xì)胞置入無血清的MEM中培養(yǎng)，根據(jù)Lipofectamine 2000操作說明按分組要求轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染siRNA（濃度為40nmol/L）。轉(zhuǎn)染6h后將培養(yǎng)基換成含10%FBS的MEM繼續(xù)溫育。

（二）CCK-8法檢測各組細(xì)胞的生長增殖

轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染后將各組細(xì)胞調(diào)成終濃度為1×10個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為：0、12 、24、48、72、96h，每小組設(shè)個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞培養(yǎng)至每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出相應(yīng)的96孔板，加入CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定細(xì)胞450nm波長處的吸光度值（OD值）。

（三）Annexin V-FITC/PI法檢測各組細(xì)胞的凋亡率

每組細(xì)胞設(shè)3復(fù)孔，轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染后將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞離心后用PBS洗滌兩次，棄上清，加入Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后加入Annexin V-FITC混勻，再加入PI，室溫避光反應(yīng)15min，在1h內(nèi)上FCM檢測細(xì)胞凋亡率。

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS8.1軟件包對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)量資料以±s 表示，采用單因素方差分析SNK法，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3組PC3細(xì)胞的生長增殖情況

根據(jù)檢測的OD值計(jì)算出生存率，其計(jì)算公式為：某時(shí)間點(diǎn)生存率（存活率）=該時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組平均OD值/該組0h的平均OD值，并根據(jù)生存率繪制各組PC3細(xì)胞存活曲線圖（圖1）。結(jié)果顯示：在第12h，各組PC3細(xì)胞存活數(shù)無明顯差異，細(xì)胞增殖均較慢；至第24 h，3組細(xì)胞存活數(shù)均緩慢升高，但干擾組PC3細(xì)胞存活數(shù)稍低于空白對照組和陰性對照組（F=6.47，P=0.03）。第48 h，兩對照組PC3細(xì)胞增殖顯著加速，而干擾組細(xì)胞增殖仍維持在較低水平；干擾組與兩對照組比較，存活數(shù)差異顯著（F=53.77，P＜0.01），而兩對照組細(xì)胞存活數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。第72h和第96h，兩對照組細(xì)胞增殖速度有所減慢，干擾組細(xì)胞增殖速度有所加速，但干擾組存活數(shù)仍明顯低于兩對照組（F72h=31.29，P72h＜0.01；F96h=14.81，P96h＜0.01）。總體來說，沉默HIF-lα基因后，PC3細(xì)胞的存活率明顯降低，以第48h下降最明顯。

圖1 3組PC3細(xì)胞的生存率曲線

二、3組PC3細(xì)胞的凋亡情況

干擾組細(xì)胞的平均凋亡率為（11.2±1.13）%，PC3組和PC3+NC siRNA組細(xì)胞平均凋亡率分別為（2.4±0.26）%和（2.5±0.36）%，干擾組較兩對照組細(xì)胞凋亡率顯著升高（F=150.14 ，P＜0.01）,而兩對照組之間無明顯差別（P＞0.05）（見圖2）。

圖2 3組PC3細(xì)胞的凋亡率比較

討 論

有報(bào)道[2]，HIF-lα在包括肺癌、前列腺癌、胃腸道惡性腫瘤、腎癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中呈特異性的高表達(dá)。HIF-lα表達(dá)上調(diào)利于腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧微環(huán)境，并加速腫瘤惡性進(jìn)程。我們前期用免疫組化方法亦證實(shí)[3-5]：HIF-lα蛋白在前列腺癌組織中高表達(dá)；HIF-lα的表達(dá)與前列腺癌的惡性程度呈正相關(guān)，與前列腺癌的形成及癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)；HIF-lα的表達(dá)與前列腺癌的臨床分期相關(guān)，它們參與了前列腺癌的惡性進(jìn)程。因此，降低HIF-lα的表達(dá)可能有抑制腫瘤的作用。RNA干擾可特異性的使特定基因的mRNA發(fā)生降解或蛋白質(zhì)翻譯抑制，從而誘發(fā)基因沉默現(xiàn)象[6]，被認(rèn)為是高效特異的降低基因表達(dá)的方法之一。本實(shí)驗(yàn)用經(jīng)證實(shí)有效的人工化學(xué)合成的HIF-lα-siRNA轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞以沉默HIF-lα基因的表達(dá)，觀察其對PC3細(xì)胞生長增殖、凋亡表達(dá)的影響。

我們采用CCK-8法測定轉(zhuǎn)染后96h內(nèi)各組PC3細(xì)胞的存活情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干擾組細(xì)胞生長增殖明顯慢于兩對照組，且這種差異在轉(zhuǎn)染后第48h顯得尤其明顯，而兩對照組之間無差異。通常轉(zhuǎn)染后24h內(nèi)就能引起細(xì)胞內(nèi)HIF-lα蛋白水平的下降，而干擾組PC3細(xì)胞在24h內(nèi)這種生長抑制變化不明顯，可能是轉(zhuǎn)染后所引起的HIF-lα的mRNA和蛋白及生物學(xué)行為的改變存在起作用的時(shí)間延遲現(xiàn)象；轉(zhuǎn)染后第48h這種蛋白水平的下降更明顯，可能是引起抑制細(xì)胞生長及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等相關(guān)的重要蛋白表達(dá)發(fā)生改變，最終表現(xiàn)為細(xì)胞生長變慢。而轉(zhuǎn)染72h后，由于siRNA從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中開始逐漸脫落，引起HIF-lα介導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制作用逐漸減弱，轉(zhuǎn)染細(xì)胞重新生長加速。因此我們認(rèn)為：siRNA沉默HIF-lα可以抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的生長增殖，具有抗腫瘤作用，這種作用在轉(zhuǎn)染后48h左右達(dá)到高峰。前列腺癌細(xì)胞的生長受多種生長因子[7,8]包括胰島素樣生長因子-（IGF-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-α（TGF-α）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等調(diào)控，而HIF-lα的高表達(dá)可刺激IGF-1、TGF-α、FGF等的分泌，促使前列腺癌細(xì)胞生長增殖。沉默HIF-lα基因有可能引起IGF-1、TGF-α、FGF等生長因子表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致腫瘤生長增殖減慢。這可能是我們在實(shí)驗(yàn)中觀察到的沉默HIF-lα基因后前列腺癌細(xì)胞的存活與增殖受到抑制的機(jī)制之一，但具體是通過哪些因子的作用，目前還不太明確，尚需進(jìn)一步的深入研究以證實(shí)。

凋亡是細(xì)胞對環(huán)境的生理性、病理性刺激信號、環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過程。HIF-lα對細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用存在著兩個(gè)不同方面：一方面，HIF-lα能增加無氧代謝、糖酵解和一些凋亡前基因的表達(dá)，起抗凋亡作用，同時(shí)HIF-lα還能與人端粒末端逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因相互作用，誘導(dǎo)活化hTERT，從而增加端粒酶的活性，延長端粒，起抗凋亡作用[9]；另一方面，HIF-lα能通過阻斷P53降解與穩(wěn)定P53、上調(diào)Bcl-2家族促凋亡基因BNIP3等途徑起到促凋亡作用[10]。因此，目前認(rèn)為HIF-lα對凋亡的雙向調(diào)控作用會(huì)因細(xì)胞類型和環(huán)境條件而異。在本研究中，我們觀察到： 干擾組PC3細(xì)胞在轉(zhuǎn)染HIF-lα-siRNA后48h，凋亡率高于其他兩對照組，但是增加的幅度不大，提示沉默HIF-lα基因在一定程度上能誘導(dǎo)PC3細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。這與Zhang等[11]報(bào)道的結(jié)果類似：利用RNA干擾下調(diào)口腔鱗狀細(xì)胞癌HIF-lα的表達(dá)水平，能顯著抑制細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。沉默HIF-lα的促凋亡作用機(jī)制可能是：HIF-lα可增加無氧代謝、糖酵解和一些凋亡前基因的表達(dá)，起抗凋亡作用，同時(shí)HIF-lα還能通過與hTERT基因的相互作用來誘導(dǎo)活化hTERT，從而增加端粒酶的活性，延長端粒，起抗凋亡作用[12]，而沉默PC3細(xì)胞的HIF-lα基因后，有可能使這種抗凋亡作用減弱，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。

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3 黃玉華, 嚴(yán)春寅, 溫端改, 等. 缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在前列腺癌組織中的表達(dá). 臨床泌尿外科雜志 2004; 19(1): 36-38

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（2014-09-17收稿）

Effects of downregulation of HIF-lα on proliferation and apoptosis of human prostate cancer cells PC3*

Fu Zhenyu1, Zhang Ge1, Huang Yuhua2**, Yan Chunyin2,
Yu Jiang3, Sun Liguo1, Chen Yongchang1, Miao Yu1**, Zhang Jie11. Department of Urology, the No 2 People's Hospital of Changshu, Changshu 215500, China; 2. Department of Urology, the First Aff liated Hospital of Soochow University; 3. Department of Urology, Aff liated Suzhou Kowloon Hospital of Shanghai
Jiao Tong University Medical School

Huang Yuhua, E-mail: hyhjxnc@163.com; Miao Yu, E-mail: miaoyu1978@sina.cn

ObjectiveTo investigate the effects of hypoxia inducible factor-lα gene silencing with siRNA on the proliferation and apoptosis of human prostate cancer cells.MethodsPC3 cells were divided into three groups such as PC3 group, PC3+ NC siRNA group and PC3 + HIF-lα siRNA group. Cells in each group were transfected with HIF-lαsiRNA using Lipofectamine 2000. CCK-8 test was used to measure the proliferation of PC3 cells. Flow cytometer was used to measure cell apoptosis.ResultsSurvival rate of PC3+HIF-lα siRNA group was signif cantly lower than that of other two control groups at 24h, 48h, 72h and 96h after transfection (P<0.01). The interference effect reached its peak at 48h after transfection. The rates of cell apoptosis of PC3 + HIF-lα siRNA group, PC3 group, PC3+ NC siRNA group at 48h after transfection were (11.2±1.13)%,(2.4±0.26)% and (2.5±0.36)% respectively; The apoptosis rates of PC3 + HIF-lα siRNA group was higher than that of the others (P<0.01).ConclusionSilencing HIF-lα gene can effectively inhibit cell proliferation, and induce the apoptosis of PC3 cells.

microRNAs; prostatic neoplasms; cell line, tumor; hypoxia inducible factor 1, alpha subunit; cell proliferation; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.12.002

R 737.25

資助: 常熟市科技發(fā)展計(jì)劃（社會(huì)發(fā)展類）項(xiàng)目（CS201425）

**共同通訊作者: 黃玉華, E-mail: hyhjxnc@163.com; 繆瑜, E-mail: miaoyu1978@sina.cn