張美華邱 毅**董云玲王磊光孫士青

1. 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)生育調(diào)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,

山東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所（濟(jì)南 250002）; 2. 山東省科學(xué)院生物研究所

茯苓多糖體外對(duì)小鼠精子膜及DNA的保護(hù)作用*

張美華1邱 毅1**董云玲1王磊光1孫士青2

1. 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)生育調(diào)控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,

山東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所（濟(jì)南 250002）; 2. 山東省科學(xué)院生物研究所

目的觀察茯苓多糖體外對(duì)小鼠精子膜功能、精子DNA 和存活率的保護(hù)作用。方法 取小鼠精子制備精子懸液，并分為正常組（PBS），生理鹽水組，維生素C組（陽(yáng)性藥對(duì)照組）和茯苓多糖低、中、高劑量組（0.5mg/mL，1.0mg/mL和5.0mg/mL）。各對(duì)照物及茯苓多糖分別與精子懸液共同孵育后，檢測(cè)精子膜完整性、DNA損傷程度及存活率，通過(guò)精子全部低滲膨脹試驗(yàn)（HOS）評(píng)估精子膜功能，精子染色質(zhì)擴(kuò)散(SCD)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精子DNA完整性，并與已知的抗氧化劑維生素C對(duì)照。結(jié)果低、中、高濃度的茯苓多糖在相同的條件下均可增加精子存活時(shí)間，提高精子存活率和活力，降低精子DNA損傷比率，對(duì)精子膜功能和DNA均具有一定的保護(hù)作用。其中1.0mg/mL和5.0mg/mL（中、高）的茯苓多糖組作用明顯優(yōu)于維生素C組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論茯苓多糖對(duì)小鼠精子膜和DNA有明顯的保護(hù)作用，并可延長(zhǎng)精子的體外存活時(shí)間。

茯苓多糖; 體外; 精子; 小鼠

人類輔助生殖技術(shù)（ART）中體外精液處理優(yōu)選精子是治療少弱畸精子癥的常用方法，通過(guò)該方法可以獲得沒(méi)有精漿、細(xì)胞碎片及病原微生物污染的精子懸液，回收足夠數(shù)量具有正常形態(tài)和功能的精子進(jìn)行宮腔內(nèi)人工授精（IUD）[1-4]。目前所用的精子營(yíng)養(yǎng)液仍有待改進(jìn)，我國(guó)所用的大多為進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格昂貴。傳統(tǒng)的中草藥作為我國(guó)人民長(zhǎng)期積累的經(jīng)驗(yàn)和總結(jié)，有巨大的開發(fā)價(jià)值和潛力[5,6]。茯苓（Poria Cocos, PC）為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，性甘、淡、平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，茯苓多用于組合方劑中，臨床主要用于水腫尿少，痰飲眩悸，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不安，驚悸失眠等。我們前期研究顯示，茯苓、麥冬等中藥具有較好的體外活化精子作用，申報(bào)發(fā)明專利已獲受理和授權(quán)。本文應(yīng)用茯苓多糖進(jìn)行體外小鼠精子孵育，觀察茯苓多糖對(duì)精子膜及精子DNA的作用，尚未見研究報(bào)道。

材料和方法

一、茯苓中藥材選取及多糖制備

干燥茯苓（購(gòu)自山東省濟(jì)南市建聯(lián)中藥店），稱取1000 g，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，加超純水10 L，中藥提取分離，濃縮，蒸發(fā)水分，獲得茯苓粗提物620 g。

參考趙子劍方法[7]。稱取茯苓粗提物100 g置500 mL圓底燒瓶中，加石油醚250 mL于60～90℃回流1h脫脂，濾過(guò)，石油醚回收。濾渣揮干溶媒后以80%乙醇250 mL浸漬過(guò)夜，80～90℃回流提取2次，每次1.5h，濾過(guò)，藥渣加蒸餾水500mL浸1h后于90℃溫浸提取40min，濾過(guò)，再用250mL蒸餾水90℃溫浸30min，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮至75mL。脫去蛋白質(zhì)，加1%活性炭脫色2次，抽濾，濾液加95%乙醇使含醇量達(dá)80%，冰箱靜置過(guò)夜。過(guò)濾，殘?jiān)来斡?5%乙醇、無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮洗滌后于60℃烘干，得褐色茯苓粗多糖。茯苓多糖的分離純化：用蒸餾水洗脫DEAE纖維素柱得到一個(gè)茯苓多糖組份，再用0～0.2mol/L氫氧化納進(jìn)行梯度洗脫，上凝膠過(guò)濾柱6次，共上樣15g，收集多糖洗脫液，于流水中透析3d，真空冷凍干燥后得精制茯苓多糖10.9 g白色固體。1g茯苓多糖加生理鹽水10mL，配置成100.0 mg/mL的茯苓多糖液，-20℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)臨時(shí)配置成0.5mg/mL，1.0mg/mL和5.0mg/mL（低、中、高）3種不同濃度。

二、方法

（一）正常精子懸液制備

選取SPF級(jí)KM雄性成年小鼠36只（由山東省疾病預(yù)防控制中心提供），取小鼠雙側(cè)附睪，置于37℃預(yù)溫的緩沖液（PBS）中，洗去毛發(fā)和血液，轉(zhuǎn)至有20 mL PBS的培養(yǎng)皿中，剪開附睪頭部，待精子充分游離后，將上清液用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，反復(fù)操作至上清液變清，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用3 mL PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為20×106個(gè)/mL備用（置37℃）。

（二）分組

分為6組：正常組、生理鹽水（對(duì)照）組、維生素C（陽(yáng)性藥對(duì)照）組和茯苓多糖液低、中、高 3個(gè)劑量組。每組各取0.2mL精子濃度為20×106個(gè)/mL的游離的小鼠精子懸液樣本，加入等量的對(duì)照樣品及茯苓多糖液溶液。正常組加入等量的PBS；生理鹽水組加入等量的生理鹽水；維生素C組終濃度為0.25 mg/ mL，加入等量的維生素C溶液；茯苓多糖液低、中、高3個(gè)劑量組，分別加入等量的0.5mg/mL，1.0mg/mL和5.0mg/mL茯苓多糖液。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2.0 h及24.0 h。

（三）曙紅-Y染色試驗(yàn)檢測(cè)精子存活率

稱取0.5g曙紅-Y（HGB3395-60，上海試劑三廠）及0.1g吉姆薩（Q/GHSC1092- 1999，上海試劑三廠），加入0.9%的生理鹽水至100mL混勻，充分溶解，配置成0.5%的曙紅-Y染液（EY），雙層濾紙過(guò)濾，濾液室溫保存?zhèn)溆?。?jīng)溫育24h后的精子懸液與等量的EY染液，室溫下放置2 min，加蓋玻片，在明視野400×顯微鏡下15 min內(nèi)觀察，死精子被染色呈粉紅色，活精子不被染色而胞質(zhì)透明，詳細(xì)方法見邱毅等報(bào)道[8]。每份標(biāo)本計(jì)數(shù)200個(gè)精子計(jì)算存活率。

（四）EY結(jié)合精子尾部低滲腫脹檢測(cè)精子膜完整性

稱取0.735g檸檬酸鈉和1.35g果糖，加雙蒸水至100 mL，配置成離子強(qiáng)度為0.15，滲透壓150 mOsm的低滲液。取0.1mL小鼠精子懸液，加入1mL 150 mOsm的低滲液中，混勻，37℃水浴30min后，加入0.1mL的EY染液，混勻。2 min后吸取50μl精液-HOS-EY混合液滴在清潔載玻片上，加蓋22mm ×22mm蓋玻片濕片封片，顯微鏡（Olympus, IX51, Japan，×400，和Leica, DM4000B, Germany, × 1000）下觀察每條精子頭部著色和尾部腫脹情況，隨機(jī)計(jì)數(shù)200條精子，計(jì)算4種類型精子的百分率。A型：尾腫脹（HOS+）-頭未染紅色（EY -），判斷為尾膜-頭膜均完整的精子。B型：尾不腫脹（HOS異常）-頭未染紅色（EY-），判斷為尾膜損傷-頭膜完整的精子。C型：尾腫脹（HOS+）-頭紅染（EY+），判斷為尾膜完整-頭膜損傷的精子。D型：尾不腫脹（HOS-）-頭紅染（EY+），判斷為尾膜—頭膜均損傷的精子。詳細(xì)方法見邱毅等報(bào)道[1,2,5]。

（五）精子染色質(zhì)擴(kuò)散（sperm chromatin dispersion test, SCD）實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Qiu等[1,2]方法進(jìn)行SCD實(shí)驗(yàn)。（1）小鼠精子懸液標(biāo)本用PBS稀釋到10×106/mL，取0.2mL與瓊脂凝膠按1:1比例混勻，放置在1.5mL的Eppendorf管內(nèi)，37℃孵育。（2）吸取50μl以上配置的小鼠精子懸液放置在用80℃下干燥的瓊脂澆制的載玻片上，蓋上蓋玻片放置4℃ 4min。（3）去除蓋玻片，22℃下放入0.08mol/L的HCl內(nèi)7min，室溫下加入0.4mol/L的Tris，0.8mol/L的 DTT，1%的SDAS，5min。（4）標(biāo)本片放入0.09mol/L的Tris和0.002mol/L的EDTA沖洗2min。（5）標(biāo)本片放入70%、90%和100%的乙醇中脫水。（6）空氣中自然干燥后加入DAPI染色，熒光顯微鏡（Nikon-E1000，日本）下觀察結(jié)果。加入瑞-吉氏染液后自然光顯微鏡下觀察精子。（7）結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)數(shù)500個(gè)精子，觀察精子光暈大小。分為大、中、小和無(wú)光暈4個(gè)等級(jí)，大和中光暈表示精子DNA完整無(wú)碎片，小和無(wú)光暈表示精子DNA斷裂為碎片。小光暈以≤精子頭直徑（精子頭裂解后）1/4為判定標(biāo)準(zhǔn)，中光暈＞精子頭直徑1/4而≤精子頭直徑2/3，大光暈＞精子頭直徑2/3。

結(jié) 果

一、茯苓多糖對(duì)精子存活率的影響

精子懸液孵育2h及24h后各組的精子存活率比均有降低。維生素C組和茯苓多糖低、中、高劑量組的精子存活率顯著高于生理鹽水組（P＜0.01）；茯苓多糖低劑量組與維生素C組無(wú)明顯差異，茯苓多糖中、高劑量組的精子存活率顯著高于維生素C組（P＜0.05及P＜0.01）（見表1）。

二、茯苓多糖對(duì)精子膜及DNA完整性的影響

36例小鼠附睪游離精子懸液分別加入生理鹽水、維生素C和茯苓多糖低、中、高劑量孵育2h及24h后各組的精子，A型、B型、C型和D型精子以及精子DNA碎片比例如表2所示。茯苓多糖低劑量組與維生素C組相比無(wú)顯著性差異，中、高劑量組顯著高于維生素C組（P＜0.01），甚至接近正常組； A型和B型精子為0，C型精子比對(duì)照組明顯減少，D型精子比對(duì)照組明顯增加（P＜0.01）。精子DNA碎片比例茯苓多糖低劑量組與維生素C組無(wú)明顯差異，但低于對(duì)照組和生理鹽水組，茯苓多糖中、高劑量組的精子DNA碎片低于正常組、生理鹽水組及維生素C 3組（P＜0.05及P＜0.01）（見表2）。

表1 各組2h及24h后EY檢測(cè)精子存活率（±s）

表1 各組2h及24h后EY檢測(cè)精子存活率（±s）

與對(duì)照組比較,*P＜0.05，**P＜0.01; 與生理鹽水組、維生素C組及低劑量茯苓多糖組比較，△P＜0.01

精子存活率(%)組別 n 劑量(C/mg?ml-1) 2h 24h正常 36 - 47.9±5.3 1.2±0.3生理鹽水 36 - 43.2±6.1 1.4±0.1維生素C 36 0.25 38.5±5.3 3.5±0.1*茯苓(低) 36 0.5 41.0±3.9 2.8±0.6*茯苓(中) 36 1.0 47.1±5.1 16.7±1.7**△茯苓(高) 36 5.0 47.2±3.6 18.2±1.2**△

表2 茯苓提物及維生素C體外孵育24 h后對(duì)小鼠精子膜及DNA的影響（n=36，±s）

表2 茯苓提物及維生素C體外孵育24 h后對(duì)小鼠精子膜及DNA的影響（n=36，±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01; 與生理鹽水組、維生素C組及低劑量茯苓多糖組比較，△P＜0.01

HOS-EY后精子膜改變類型 (%) SCD (%)劑量(C/mg?ml-1) A B C D DNA碎片對(duì)照組 - 9.4±1.3 2.6±0.5 40.2±1.7 47.8±2.1 11.8±1.2生理鹽水 - 8.5±1.2*2.5±0.8 40.0±2.1 49.0±3.1*12.1±1.1維生素C 0.25 10.0±1.6 2.0±0.7 41.4±5.1 46.6±3.2*10.9±1.0**茯苓(低) 0.5 10.9±1.5*2.1±0.6 41.3±4.1 45.7±4.9*9.5±1.2**△茯苓(中) 1.0 12.3±1.8**△2.7±0.6 40.0±3.1 45.0±3.2**△8.6±1.1**△茯苓(高) 5.0 13.9±1.3**△2.1±0.7 39.5±3.1 44.5±3.2**△7.9±0.8**△

討 論

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，多寄生于馬尾松或赤松的根部。茯苓是一味使用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，其性平，味甘、淡，具有利水滲濕、健脾和胃、寧心安神的作用，中醫(yī)主要用其治療小便不利，水腫，脾胃氣虛，食少便溏，體倦乏力以及心神不寧，驚悸，失眠等癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明茯苓具有腫瘤抑制、免疫增強(qiáng)、抗炎等多方面的藥理作用；其主要化學(xué)成分為多糖和三萜。對(duì)于脾虛運(yùn)化失常所致泄瀉、帶下，應(yīng)用茯苓有標(biāo)本兼顧之效?，F(xiàn)代中醫(yī)研究顯示，茯苓能祛斑增白、潤(rùn)澤皮膚，擴(kuò)張血管，還可以增強(qiáng)免疫功能和抗腫瘤，茯苓多糖對(duì)小鼠肉瘤有抑制作用，其作用與胸腺有關(guān)，可激活局部補(bǔ)體。茯苓無(wú)毒副作用，是一種藥食兼?zhèn)涞恼婢?。枸杞子、茯苓、山楂?種最常用的既是食品又是藥品的原料。茯苓餅既桂香濃郁，又營(yíng)養(yǎng)豐富，且有安神益脾等滋補(bǔ)之功。茯苓多糖能顯著降低動(dòng)物體內(nèi)自由基水平，提高動(dòng)物體內(nèi)自由清除酶的活力，提高動(dòng)物耐寒和抗疲勞能力，說(shuō)明茯苓多糖具有較好的抗衰老作用[7]。 但其體外活化精子作用尚未見有研究報(bào)道。

菌類中所含的有效成分，以多糖最為引人矚目，多糖又稱為聚糖，由單糖聚合而成，其相對(duì)分子質(zhì)量一般為數(shù)萬(wàn)甚至達(dá)到百萬(wàn)，廣泛存在于植物的細(xì)胞壁中，是構(gòu)成生命的四大物質(zhì)之一。臨床研究顯示，茯苓多糖對(duì)鼻咽癌、胃癌有一定療效，它能通過(guò)影響巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其他細(xì)胞、體液因子協(xié)同殺滅腫瘤細(xì)胞，其原理與激活機(jī)體的腫瘤免疫監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，影響腫瘤細(xì)胞的分裂與增殖，抑制DNA復(fù)制，干擾DNA或介導(dǎo)DNA斷裂，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[7,9]。茯苓多糖體外對(duì)精子的活化有較明顯的作用，尚未見研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)表明，茯苓多糖體外對(duì)小鼠精子膜及精子DNA具有保護(hù)作用，可能是其增強(qiáng)精子的活動(dòng)能力，延長(zhǎng)精子體外存活時(shí)間的主要作用機(jī)制。盡管茯苓以復(fù)方形式多次出現(xiàn)在治療男性少精子、弱精子癥不育的中藥配伍中，但就其所發(fā)揮作用的機(jī)制研究尚不全面，尤其在研究其體外保護(hù)精子功能方面還是新的嘗試。茯苓多糖的作用呈劑量依賴性，中、高劑量（1.0 mg/mL及5mg/mL）時(shí)對(duì)精子存活時(shí)間延長(zhǎng)較為顯著，是正常組（不加藥物，只加PBS）的12～15倍（1.4/16.7-18.2），而維生素C也可明顯延長(zhǎng)小鼠精子的體外存活時(shí)間，與茯苓多糖低劑量組效果相同，但明顯低于茯苓多糖中、高劑量組。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，適量茯苓多糖能顯著提高小鼠精子體外存活率，減少小鼠精子膜及DNA的損傷，對(duì)精子膜結(jié)構(gòu)和功能具有明顯的保護(hù)作用，有可能在治療弱精子癥不育患者時(shí)，為體外處理及活化精子提供很好的精子營(yíng)養(yǎng)液，為治療弱精子癥男性不育開辟新的途徑。

1 Qiu Y, Wang LG, Zhang LH,et al. Sperm chromosomal aneuploidy and DNA integrity of infertile men with anejaculation.J Assist Reprod Genet2012; 29(2): 185-194

2 Qiu Y, Wang LG, Zhang LH,et al. Quality of Sperm Obtained by Penile Vibratory bratory Stimulation and Percutaneous Vasal Sperm Aspiration in Men with Spinal Cord Injury.J Andrology2012; 33(5):1036-1046

3 World Health Organisation. Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction, 4th ed, New York: Cambridge University Press. 1999

4 Qiu Yi, Wang SM, Yang DT,et al. Percutaneous vasal sperm aspiration and intrauterine insemination for infertile males with anejaculation.Fertil Steril2003; 79(3): 618-620

5 Qiu Y, Wang LG, Jia YF,et al. The effects of the extract of Chinese Polygala tennuidolia willd on human sperm in vitro.J Zhejiang Univ Sci B2011; 12(6): 448-454

6 邱毅, 王磊光, 賈頤舫, 等. 桔梗粗提物及桔梗皂苷D體外殺精子活性機(jī)制研究. 中華醫(yī)學(xué)雜志 2010; 90(44): 3107-3111

7 趙子劍. 茯苓多糖的提取方法優(yōu)選. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥2009; 20(9): 2207-2208

8 邱毅, 王磊光, 張麗紅, 等. 男性不育患者精子染色體畸變及精子DNA完整性分析. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志2008; 25(6): 681-685

9 石延榜, 趙娟, 賀?；? 茯苓飲片規(guī)格的研究. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥 2008; 8(12): 200-201

（2013-12-25收稿）

Effects of pachyman from Poria cocos on mouse sperm membrane and DNAin vitro*

Zhang Meihua1, Qiu Yi1**, Dong Yunling1, Wang Leiguang1, Sun Shiqing21. Key Laboratory for Improving Birth Outcome Technique, Shandong Institute for Family Planning, Jinan 250002, China;
2. Biology Institute of Shandong Acadamy of Sciences

Qiu Yi, E-mail: Email: qiuyi987@sina.com

ObjectiveTo explore the protective effects of crude extract from Poria cocos on mouse sperm membrane, sperm DNA and viabilityin vitro.MethodsMice sperm suspension was prepared in PBS, and divided into normal group (PBS), and normal saline group, positive control group (vitamin C) and the low, medium and high dose group(treated with crude extractings from poria cocosuse using a dose of 0.5mg/mL, 1.0mg/mL and 5.0 mg/mL). After the sperms were incubated with the crude extracts, their DNA damaged level and membrane integrity were detected by the improved Eosin-Y (EY) staining, hypo-osmotic swelling (HOS) test and the sperm chromatin dispersion (SCD) test respectively.ResultsThe low, medium and high dosage of crude extractings all prolonged sperm survival time and improved the sperm vitality, reduced the percentage of sperm DNA damage in vitro. Of which, middle and high dose of crude extractings were signif cantly better than vitamin C group in sperm vitality and sperm DNA damaged level (P<0.05 orP<0.01).ConclusionThe crude extracts from poria cocos had signif cant protective effects on mice sperm membrane and DNA.

pachyman from Poria cocos; in vitro; spermatozoa; mice

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.003

R 321.1

資助: 本項(xiàng)目為山東省自然科學(xué)基金資助（基金號(hào)：ZR2010HM016）**

, Email: qiuyi987@sina.com