鐘文婕，柳占彪，王安紅，田文全

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

壯骨1號方鎮(zhèn)痛抗炎作用研究*

鐘文婕，柳占彪，王安紅，田文全

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

[目的]觀察壯骨1號方鎮(zhèn)痛和抗炎作用。[方法]采用小鼠熱板法和醋酸扭體法，觀察壯骨1號方的鎮(zhèn)痛作用；采用木瓜蛋白酶緩釋劑法建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型，觀察壯骨1號方的抗炎作用。[結(jié)果]壯骨1號方3．08、1．54g/kg劑量能明顯延長熱板所致的小鼠舔后足時間（60 min，19．78 s，P＜0．05和20．56 s，P＜0．01）、（90 min，20．67 s和20．56 s，P＜0．05），顯著減少小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)（P＜0．01）；壯骨1號方各劑量能明顯減少大鼠白細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)（P＜0．01），降低大鼠關(guān)節(jié)周圍軟組織IL-6含量（P＜0．01）、降低關(guān)節(jié)液IL-6和前列腺素E2（PGE2）含量（P＜0．01）。[結(jié)論]壯骨1號方具有明顯的鎮(zhèn)痛和抗炎作用。

壯骨1號方；鎮(zhèn)痛；抗炎

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是以關(guān)節(jié)軟骨損傷為特征的退行性關(guān)節(jié)病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、畸形、功能障礙、走路疼痛等[1]，以中老年居多，隨著社會人口老齡化的到來，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注和重視。近年來中醫(yī)藥治療OA的研究取得了一定的進(jìn)展[2]。壯骨關(guān)節(jié)丸是治療OA的經(jīng)典方，主要由熟地黃、補(bǔ)骨脂、淫羊藿、獨活、續(xù)斷等組成，用于肝腎不足、氣滯血瘀、脈絡(luò)痹阻所致的OA、腰肌勞損，但臨床報道該藥會引起肝損害[3-4]，為此，本課題組在壯骨關(guān)節(jié)丸經(jīng)典方的基礎(chǔ)上進(jìn)行了壯骨1號方的研究，本實驗對壯骨1號方的鎮(zhèn)痛和抗炎作用進(jìn)行了實驗觀察。

1 材料

1.1動物 昆明種小鼠，18～22 g，雌性，SPF級，天津?qū)嶒瀯游镏行?，合格證號：SCXK(津)2010-0002，批號：0004259。SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，天津市山川紅實驗動物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)合格證：SCXK（津）2009-0001。質(zhì)量合格證：0004244。

1.2藥物 壯骨1號方（自制，批號：1006103）；壯骨關(guān)節(jié)丸（批號：1011231S），華潤三九醫(yī)藥股份有限公司；木瓜蛋白酶(批號：118K1465)，泊洛沙姆（批號：P2443），Sigma公司。

1.3試劑 冰醋酸（批號：20101221），天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司。大鼠前列腺素E2（PGE2）ELISA試劑盒（批號：291348），美國R＆D公司。大鼠白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（批號：113102/A），美國Invitrogen公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012），上海碧云天公司。

1.4儀器 HSS-1（B）恒溫浴槽，成都儀器廠。熱板槽，秒表，計數(shù)器。全自動血細(xì)胞分析儀，MEK-7222K型，日本光電工業(yè)株式公社。離心機(jī)，LDZ5-2型，北京芬格爾華安科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)。渦旋混合器，QL-901型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。振蕩器，KJ-201A型，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司。雜交箱，MODEL 1012型，SHEL LAB，美國。多功能酶標(biāo)儀，F(xiàn)lexStation 3，Molecular Devices公司，美國。

2 方法

2.1小鼠熱板實驗[5]選昆明小鼠，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，分別置于恒溫?zé)岚宀凵希?5±0．5）℃，從小鼠放入熱板槽開始計時，以舔后足為痛反應(yīng)指標(biāo)，將痛閾值在5～30 s之間的小鼠用于實驗。選符合實驗要求的小鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，分別為空白對照組、壯骨1號方3．08、1．54、0．77 g/kg劑量組和壯骨關(guān)節(jié)丸1．54 g/kg組，每組10只。按每只0．5 mL的給藥量，每日1次，連續(xù)灌胃治療3 d。對照組灌胃等量體積的蒸餾水。分別在給藥前和給藥結(jié)束后30、60、90 min，測定小鼠的痛閾值。

2.2小鼠醋酸扭體實驗[6]選昆明小鼠60只，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，分別為空白對照組、壯骨1號方3．08、1．54、0．77 g/kg劑量組和壯骨關(guān)節(jié)丸1．54 g/kg對照組，每組10只。按每只0．5 mL的給藥量，每日1次，連續(xù)灌胃治療5 d，空白對照組灌胃等量體積的蒸餾水。末次給藥后30 min，每只小鼠分別腹腔注射0．6%冰醋酸0．2 mL（現(xiàn)配現(xiàn)用），觀察并記錄注射后15 min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)（以腹部內(nèi)凹，伸展后肢，臀部抬高為標(biāo)準(zhǔn)），比較給藥組與對照組之間的差異并計算扭體反應(yīng)抑制率。

扭體反應(yīng)抑制率（100%）=（對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù)扭體）÷對照組平均扭體次數(shù)×100%。

2.3抗炎實驗

2.3.1造模[7]選健康雄性SD大鼠，按3 mL/kg腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)注射4%木瓜蛋白酶35%泊洛沙姆磷酸緩沖溶液（pH= 5．7），每側(cè)0．05 mL，50℃恒溫作用2 h。

2.3.2分組與灌胃 選成功骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、壯骨1號方2．20、1．10、0．55 g/kg劑量組和壯骨關(guān)節(jié)丸1．10 g/kg組，每組8只，另選健康雄性SD大鼠8只，作為正常對照組。按不同的劑量灌胃給藥，連續(xù)治療3 d，正常組和模型組灌等體積蒸餾水。

2.3.3取材 治療結(jié)束后，麻醉，腹主動脈取血，打入按9∶1預(yù)先含有枸櫞酸的炮彈管中，上下振搖使其充分混勻做血常規(guī)；剩余血液3 500 r/min離心10 min，分離血清；打開左膝關(guān)節(jié)腔，用0．8 mL生理鹽水反復(fù)沖洗3次，收集關(guān)節(jié)液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，4℃保存；用小刀刮取股骨關(guān)節(jié)和脛骨關(guān)節(jié)周圍的軟組織，稱質(zhì)量，按質(zhì)量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液，4℃保存。

2.4統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18．0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。正態(tài)分布計量資料組間比較采用單因素方差分析，組間

兩兩比較時，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法；偏態(tài)分布計量資料組間比較采用秩和檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1小鼠熱板法實驗結(jié)果 給藥后60、90 min，壯骨1號方3．08、1．54 g/kg劑量小鼠痛閾值明顯增加，與空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05或P＜0．01）。結(jié)果表明：壯骨1號方能明顯延長小鼠的痛反應(yīng)時間，能有效緩解物理性熱刺激，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。見表1。

表1 壯骨1號方對小鼠熱板痛反應(yīng)的影響（±s）Tab.1 Effect of hot plate pain reaction on mice by Zhuanggu Yihao prescription（±s）

表1 壯骨1號方對小鼠熱板痛反應(yīng)的影響（±s）Tab.1 Effect of hot plate pain reaction on mice by Zhuanggu Yihao prescription（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

組別空白對照組壯骨1號方3．08 g/kg組壯骨1號方1．54 g/kg組壯骨1號方0．77 g/kg組壯骨關(guān)節(jié)丸1．54 g/kg組動物數(shù)（只）10 10 10 10 10痛閾值（s）給藥前 30 min 60 min 90 min 15．44±3．28 14．67±3．00 15．11±2．52 16．00±2．87 14．67±2．91 19．00±9．58 19．78±4．63* 20．67±3．97* 16．11±2．52 17．22±3．53 20．56±6．19** 20．56±6．48* 14．78±3．49 19．86±9．23 18．00±3．84 19．56±4．64 16．56±3．97 19．56±3．84 19．78±1．56* 20．78±1．56*

3.2小鼠醋酸扭體實驗結(jié)果 壯骨1號方3．08、1．54、0．77 g/kg劑量能明顯降低因醋酸刺激引起的扭體反應(yīng)次數(shù)，與空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），其中壯骨1號方3．08 g/kg劑量扭體抑制率最高。結(jié)果表明：壯骨1號方都能明顯減少小鼠扭體的次數(shù)，提示壯骨1號方具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。見表2。

3.3抗炎結(jié)果

3.3.1血液白細(xì)胞及分類檢查結(jié)果 模型組大鼠血液中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞總數(shù)明顯升高，與正常組大鼠差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），說明造模后，引起了大鼠關(guān)節(jié)的急性炎癥。用壯骨1號方2．20 g/kg和1．10 g/kg和0．55 g/kg劑量灌胃治療3 d后，大鼠白細(xì)胞總數(shù)明顯降低（P＜0．05或P＜0．01），中性粒細(xì)胞也顯著性下降（P＜0．01）。結(jié)果表明：壯骨1號方具有抗炎作用。見表3。

3.3.2壯骨1號方對OA大鼠IL-6和PGE2含量的影響 模型組大鼠關(guān)節(jié)周圍軟組織和關(guān)節(jié)液中IL-6含量明顯高于正常組（P＜0．01）；壯骨1號方灌胃治療3 d后，大鼠IL-6含量明顯降低，與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05或P＜0．01）。模型組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6和PGE2含量明顯高于正常組（P＜0．01），壯骨1號方灌胃3 d治療后，大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6和PGE2含量明顯降低，與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。結(jié)果表明：壯骨1號方抑制關(guān)節(jié)軟骨破壞可能是通過減少炎癥細(xì)胞因子IL-6和PGE2的破壞作用實現(xiàn)的，提示其對骨關(guān)節(jié)炎的療效與其抑制關(guān)節(jié)內(nèi)的IL-6和PGE2水平密切相關(guān)。見表4。

表2 壯骨1號方對小鼠醋酸扭體的影響（±s）Tab.2 Effect of acetic acid writhing on mice by Zhuanggu Yihao prescription（±s）

表2 壯骨1號方對小鼠醋酸扭體的影響（±s）Tab.2 Effect of acetic acid writhing on mice by Zhuanggu Yihao prescription（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別空白對照組壯骨1號方3．08 g/kg組壯骨1號方1．54 g/kg組壯骨1號方0．77 g/kg組壯骨關(guān)節(jié)丸1．54 g/kg組動物數(shù)（只）10 10 10 10 10扭體數(shù)（次） 扭體抑制率（%）22．42±3．36** 100．00 11．56±4．82** 051．09 14．67±4．64** 037．92 14．33±6．56** 039．33 13．78±4．79** 041．68

表3 壯骨1號方對血液白細(xì)胞及分類的影響（±s）Tab.3 Effect of Zhuanggu Yihao prescription on blood leukocytes and classification（±s）

表3 壯骨1號方對血液白細(xì)胞及分類的影響（±s）Tab.3 Effect of Zhuanggu Yihao prescription on blood leukocytes and classification（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常組模型組壯骨1號方2．20 g/kg組壯骨1號方1．10 g/kg組壯骨1號方0．55 g/kg組壯骨關(guān)節(jié)丸1．10 g/kg組動物數(shù)（只）8 8 8 8 8 8白細(xì)胞總數(shù)（×109/L） 中性粒細(xì)胞（×109/L） 淋巴細(xì)胞數(shù)（×109/L）4．07±1．68 2．23±0．84 2．00±0．89 6．02±1．34** 4．62±1．27** 1．31±0．42* 2．92±1．96##1．92±1．28##0．97±0．81** 4．07±2．88#2．45±1．64##1．62±1．28 3．67±0．94##2．57±0．55##2．02±2．83** 3．77±1．75##2．51±1．25##1．24±0．67*

表4 壯骨1號方對OA大鼠IL-6和PGE2含量的影響（±s）Tab.4 Effect of Zhuanggu Yihao prescription on the IL-6 and PGE2 in rats with OA（±s）

表4 壯骨1號方對OA大鼠IL-6和PGE2含量的影響（±s）Tab.4 Effect of Zhuanggu Yihao prescription on the IL-6 and PGE2 in rats with OA（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常組模型組壯骨1號方2．20 g/kg組壯骨1號方1．10 g/kg組壯骨1號方0．55 g/kg組壯骨關(guān)節(jié)丸1．10 g/kg組動物數(shù)（只）6 6 6 6 6 6關(guān)節(jié)液IL-6（pg/mg） 關(guān)節(jié)液PGE2（pg/mg） 關(guān)節(jié)周圍軟組織IL-6（pg/mL）12．81±05．89 753．17±658．50 179．71±40．10 101．68±85．10** 3 935．91±1 469．24** 427．18±35．37** 15．44±12．29##1 560．03± 681．48##326．89±27．54**#16．02±05．08##1 502．90± 554．13##288．16±57．48*##28．74±18．47##995．26± 503．62##254．51±54．15##36．32±25．48##2 387．04± 527．75* 273．79±40．10##

4 討論

壯骨關(guān)節(jié)丸具有較好的臨床鎮(zhèn)痛作用，但未見實驗研究報道，其組方中獨活、乳香、沒藥等單味藥的鎮(zhèn)痛作用已有報道。有研究顯示[8]采用小鼠熱板法及小鼠扭體法對40只小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，獨活揮發(fā)油0．29 g/kg（生藥96．66 g）劑量具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。另有報道[9]采用小鼠扭體法對24只小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，乳香沒藥揮發(fā)油0．102 g/kg（生藥5．66 g）劑量具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。本實驗采用小鼠熱板法及小鼠扭體法，結(jié)果表明壯骨1號方在1．54 g/kg劑量，壯骨關(guān)節(jié)丸在1．54 g/kg劑量（獨活生藥為0．7g，乳香沒藥生藥為1．4 g），均具有鎮(zhèn)痛作用。從單味藥的給藥劑量和在壯骨1號方、壯骨關(guān)節(jié)丸中單味藥的給藥劑量比較，復(fù)方中的用藥劑量均小于單味藥的給藥劑量，由此認(rèn)為復(fù)方具有協(xié)同增效作用。

本實驗還對壯骨1號方的抗炎作用進(jìn)行了研究，主要研究PGE2和IL-6這兩個炎癥因子，它們在關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。PGE2作為炎癥因子在疼痛尤其是炎癥性疼痛的外周和中樞中扮演重要角色。有學(xué)者對16例疼痛性患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射醋酸強(qiáng)的松龍治療，測定治療前后關(guān)節(jié)液中PGE2含量，結(jié)果注藥后3周和9周滑液中PGE2含量較注藥前有顯著下降（P＜0．01），同時關(guān)節(jié)疼痛癥狀明顯改善，表明PGE2含量與關(guān)節(jié)疼痛密切相關(guān)[10]。研究表明可以通過降低關(guān)節(jié)滑液PGE2含量抑制炎癥反應(yīng)，改善關(guān)節(jié)周圍組織的痛覺過敏狀態(tài)，緩解疼痛，達(dá)到治療OA的效果[11]。目前認(rèn)為抑制體內(nèi)PGE2的生物合成是解熱疼痛抗炎藥共同的作用基礎(chǔ)[12]。IL-6在炎癥中具有重要作用，抑制IL-6合成是抗炎的有效途徑[13]。有研究利用藥物干預(yù)，有效降低了軟骨及血清IL-6，從而減輕炎癥及免疫反應(yīng)[14]。亦有研究觀察丹歸消腫膏治療大鼠急性軟組織損傷的腫脹、瘀斑消退情況及IL-6和PGE2含量變化，結(jié)果顯示丹歸消腫膏能快速消除軟組織腫脹、瘀斑，抑制損傷局部的IL-6和PGE2含量，減少損傷局部炎性反應(yīng)[15]。另有學(xué)者觀察膝關(guān)節(jié)液中IL-18、PGE2、IL-6含量，結(jié)果表明關(guān)節(jié)滑液中PGE2、IL-6含量增加，并與IL-18呈正相關(guān)[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)壯骨1號方和壯骨關(guān)節(jié)丸能夠降低OA大鼠PGE2和IL-6含量，提示壯骨1號方和壯骨關(guān)節(jié)丸的鎮(zhèn)痛抗炎作用機(jī)制是通過阻斷PGE2和IL-6的合成實現(xiàn)的。

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Research on effect of Zhuanggu Yihao prescription in agalgesia and anti-inflammatory action

ZHONG Wen-jie,LIU Zhan-biao,WANG An-hong,TIAN Wen-quan
（Research Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To observe the effects of Zhuanggu Yihao prescription in the analgesia and anti-inflammatory action．[Methods]Using the method of mouse hot plate and acetic acid writhing the analgesia of Zhuanggu Yihao prescription was observed;papain was injected into rat’s knee joints to establish the animal model of osteoarthritis and to observe the anti-inflammation by Zhuanggu Yihao prescription．[Results]The pain caused by the hot plate was significantly extended in Zhuanggu Yihao prescription of 3．08,1．54g/kg dose group (60 min,19．78 s,P＜0．05 and 20．56 s,P＜0．01),(90 min,20．67s and 20．56 s,P＜0．05),and the number of writhing was reduced in Zhuanggu Yihao prescription of 3．08,1．54g/kg dose group (P＜0．01)．Zhuanggu Yihao prescription could obviously reduce the leukocyte count and neutrophil count(P＜0．01),and reduce the contents of IL-6 in the soft tissue homogenate（P＜0．01）and reduce the contents of IL-6 and PGE2in synovial fluid（P＜0．01)．[Conclusion]Zhuanggu Yihao prescription has significant analgesia and anti-inflammatory effect．

Zhuanggu Yihao prescription;analgesia;anti-inflammatory

R285．6

A

1672-1519（2014）12-0752-04

2014-06-14）

（本文編輯：馬 英，于春泉）

10．11656/j．issn．1672-1519．2014．12．15

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2011ZX 09201-201-21）。

鐘文婕（1989-），女，碩士，主要從事中藥藥理研究。

柳占彪，E-mail：634256747＠qq．com。