劉慧敏，杜守穎，陸 洋，李鵬躍，馮健男

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

大孔樹脂純化葛根的使用次數(shù)和再生方法*

劉慧敏，杜守穎，陸 洋，李鵬躍，馮健男

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

[目的]研究HPD-200A型大孔樹脂在純化葛根素及葛根總黃酮時(shí)的使用壽命和再生方法。[方法]以葛根總黃酮和葛根素的吸附容量和精致后的純度為指標(biāo)，考察大孔樹脂在多次吸附洗脫和再生后的吸附洗脫能力的變化。[結(jié)果]樹脂初次使用時(shí)，葛根素吸附容量約為17.29 g/L，總黃酮的吸附容量約為46.00 g/L，兩者的純度為32.40%和75.52%，連續(xù)使用11次后葛根素吸附容量為原來的82.26%，總黃酮的吸附容量為原來的80.99%，兩者純度為27.23%和67.99%，純度略有降低。用95%乙醇再生處理后，HPD-200A大孔樹脂對(duì)葛根素和總黃酮的吸附容量分別可達(dá)到新樹脂的94.35%和91.87%，兩者的純度也均可達(dá)到新樹脂的97%以上。[結(jié)論]使用HPD-200A型大孔樹脂精制葛根時(shí)，新樹脂可連續(xù)使用11次，用95%乙醇再生后，至少可連續(xù)使用3次，即一批HPD-200A型樹脂至少可使用14次,本研究為葛根純化工藝的產(chǎn)業(yè)化確定提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考。

大孔樹脂；葛根；總黃酮；再生

大孔樹脂是一種不溶于酸堿及各種有機(jī)溶劑，對(duì)氧、熱、化學(xué)試劑穩(wěn)定且機(jī)械強(qiáng)度高的有機(jī)高分子聚合物，還具有良好的吸附性能[1]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、化學(xué)工業(yè)、臨床鑒定、抗菌藥物及生化藥物的分離純化等領(lǐng)域[2]，尤其在中國的中藥現(xiàn)代化研究中，應(yīng)用大孔樹脂分離富集中藥有效成分及中藥復(fù)方有效部位已越來越受到重視[3-5]。

葛根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根,具有解肌退熱、透發(fā)麻疹等功效，臨床上主要用于外感發(fā)熱頭痛、高血壓、頸項(xiàng)強(qiáng)痛、口渴等癥[6]。目前，對(duì)葛根的分離純化研究越來越多，其中以大孔樹脂純化效果最佳[7]，因此大孔樹脂分離純化葛根素的研究越來越多[7-11]，且非極性樹脂對(duì)葛根素和總黃酮顯示較好的吸附性能[7]，但涉及樹脂使用壽命和再生的研究卻較少。HPD-200A型大孔樹脂是以苯乙烯為骨架的非極性樹脂[12]，實(shí)驗(yàn)室前期已考察了HPD-200A大孔樹脂純化葛根的工藝，但每批樹脂的預(yù)處理花費(fèi)時(shí)間很長，每批處理量小、耗時(shí)長而且耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑，污染環(huán)境，成本高?？紤]大生產(chǎn)應(yīng)省時(shí)并節(jié)約成本，本實(shí)驗(yàn)在已有的葛根純化工藝基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了HPD-200A型大孔樹脂的使用次數(shù)及再生方法，以期為該工藝的大生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT液相色譜儀，LC-20AT色譜泵,SPD-20A紫外檢測(cè)器，LC Solution色譜工作站（日本島津公司），SP-756（PC）型紫外可見分光光度計(jì)（Spectrum shanghai），15 mm×500 mm的玻璃柱，Sartorius BS 110S型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），CX-100型超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥 葛根飲片（北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心，批號(hào)：204261），葛根素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究所，批號(hào)：110752-00912，供含量測(cè)定用），HPD-200A型大孔樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司），冰醋酸（北京化工廠，批號(hào)20080708），甲醇為色譜級(jí)，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 總黃酮的測(cè)定 通過全波長掃描可知，葛根提取物和葛根素溶液均在250 nm波長有最大吸收，故在250 nm波長測(cè)吸光度，計(jì)算其總黃酮含量。

精密稱取葛根素對(duì)照品10.40 mg于10 mL容量瓶中，無水乙醇定容。精密量取該溶液2 mL于25 mL容量瓶中，無水乙醇定容。精密量取上述溶液0.1、0.2、0.25、0.5、1、1.5、2 mL于10 mL容量瓶中，無水乙醇定容。以無水乙醇為參比溶液，在250 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A與對(duì)照品溶液濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=0.804C+0.020 3，r2= 0.998 8，線形范圍為0.832～16.64 μg/mL。

精密度、12 h穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率實(shí)驗(yàn)RSD值分別為0.43%、0.53%、2.27%、1.99%，符合要求。

2.1.2 葛根素的測(cè)定

2.1.2.1 色譜條件 TIANHE Kormasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇:1%醋酸溶液（22∶78），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長250 nm。

梯度洗脫程序：0～20 min，甲醇-1%醋酸溶液（22∶78）；20～25 min，甲醇-1%醋酸溶液（90∶10）；25～40 min，甲醇-1%醋酸溶液（22∶78）。

2.1.2.2 方法學(xué)考察 精密稱取葛根素對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋為 5.32、10.63、21.26、63.78、85.04、106.30 μg/mL的對(duì)照品溶液，準(zhǔn)確量取各溶液10 μL進(jìn)樣。以樣品的峰面積（A）和對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C），應(yīng)用最小二乘法線性回歸處理后得方程為A=47 259C+2 524.2，r=0.999 9，在質(zhì)量濃度5.32～106.30 μg/mL，方程的線性良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

葛根素乙醇溶液低、中、高濃度（21.26，53.15，85.04 μg/mL）精密度實(shí)驗(yàn)的RSD分別為0.11%、0.18%、0.27%，符合要求。

2.2 藥液制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取葛根素對(duì)照品10.40 mg于10 mL容量瓶中，無水乙醇定容。精密量取該溶液2 mL于25 mL容量瓶中，無水乙醇定容，得83.2 μg/mL的葛根素對(duì)照品溶液。

自制葛根粗提物:粗提物干燥成干膏，干膏中葛根素和總黃酮含量分別為12.08%和31.42%，取其干膏配成6.75%的水溶液，作為上樣液。

2.3 大孔樹脂吸附葛根素及總黃酮使用壽命的考察 HPD-200A型大孔樹脂用95%乙醇加熱回流，至回流液在250 nm處無紫外吸收，再用蒸餾水洗至無醇味。取3份已處理過的樹脂13 mL（干質(zhì)量約2.87 g），分別裝入3根內(nèi)徑1.5 cm的樹脂柱中，取自制葛根粗提液，上樣2 BV（1BV即1倍樹脂柱體積），水洗2 BV，30%乙醇洗4 BV。收集每次的上樣滴出液、水洗液和醇洗液，分別定容于50、50、100 mL的容量瓶中。最后用適量蒸餾水沖洗樹脂至滴出液無醇味，完成1次使用[13]。重復(fù)以上操作，計(jì)算出每次的吸附容量，共進(jìn)行13次吸附。

收集的上樣滴出液定容后，按含量測(cè)定方法測(cè)定滴出液中葛根素和總黃酮含量，計(jì)算吸附容量。

公式：D=1 000（C1V1-C2V2）/V

D：吸附容量（g/L），C1：上樣液中葛根素或總黃酮濃度（μg/mL），V1：上樣液中葛根素或總黃酮體積（mL），C2：上樣滴出液中葛根素或總黃酮濃度（μg/mL），V2：上樣滴出液中葛根素或總黃酮體積（mL），V：樹脂體積（mL）。

以吸附次數(shù)為橫坐標(biāo)，吸附容量為縱坐標(biāo)，作圖，見圖1。

圖1 HPD-200A大孔樹脂使用次數(shù)增加，葛根素和總黃酮的吸附容量變化趨勢(shì)圖(±s,n=3)Fig.1 Adsorption capacity of HPD-200A macroporous resin varies with times to purify puerarin and total flavonoids(±s,n=3)

圖1表明：樹脂初次使用時(shí)，葛根素吸附容量約為17.29 g/L，總黃酮的吸附容量約為46.00 g/L，使用次數(shù)增加，樹脂吸附能力有所下降，連續(xù)使用13次后葛根素吸附容量為原來的80.10%，總黃酮的吸附容量為原來的79.76%。

HPD-200A型大孔樹脂由偶極矩很小的單體聚合制得的，不帶任何功能基[14]，其作用源于樹脂表面的不均勻性和孔填充機(jī)制[15]。樹脂使用時(shí)，吸附質(zhì)優(yōu)先占據(jù)能量有利的位置。使用次數(shù)增加，樹脂表面及內(nèi)部都會(huì)殘留許多非吸附性成分或雜質(zhì)，導(dǎo)致樹脂表面被覆蓋或孔道被部分填充，待測(cè)物再次填充難度增大，吸附量下降，考察樹脂柱連續(xù)使用次數(shù)時(shí)，當(dāng)樹脂柱吸附容量下降30%以上，則認(rèn)為該樹脂需要再生或停止使用[16-17]，因此HPD-200A樹脂用于吸附葛根提取液至少可以使用13次。

收集每次的醇洗滴出液定容于100 mL容量瓶，再取0.25 mL定容于25 mL容量瓶進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算解吸率。以吸附次數(shù)為橫坐標(biāo)，解吸率為縱坐標(biāo)，作圖，見圖2。同時(shí)取出10 mL放入已知質(zhì)量的蒸發(fā)皿中水浴揮干，計(jì)算干膏質(zhì)量及葛根素與總黃酮的純度，結(jié)果見圖3。

圖2 HPD-200A大孔樹脂使用次數(shù)增加，葛根素和總黃酮的解吸率變化趨勢(shì)圖(±s,n=3)Fig.2 Desorption capacity of HPD-200A macroporous resin varies with times to purify puerarin and total flavonoids(±s,n=3)

圖3 HPD-200A大孔樹脂使用次數(shù)增加，葛根素和總黃酮的純度變化趨勢(shì)圖(±s,n=3)Fig.3 The purity of puerarin and total flavonoids varies with the used frequency of HPD-200A macroporous resin (±s,n=3)

圖2和圖3表明：使用次數(shù)增加，葛根素和總黃酮的解吸率都呈緩慢下降而后增加的趨勢(shì)；而兩者的純度先逐漸降低，使用11次后有明顯下降趨勢(shì)。

隨著使用次數(shù)的增加，樹脂中殘留的雜質(zhì)增加，雜質(zhì)的表面基團(tuán)和靜電可能吸附待分離物，導(dǎo)致溶劑對(duì)其洗脫能力下降，解吸率減小，純度也相應(yīng)減小。當(dāng)雜質(zhì)積累至一定程度，部分被沖洗出，同時(shí)被洗出的待測(cè)物也增加，解吸率升高，純度反而降低。

2.4 大孔樹脂再生方法考察 用HPD-200A型大孔樹脂純化葛根，當(dāng)樹脂使用13次后，吸附容量下降了20%左右，葛根素和總黃酮純度僅為初次使用時(shí)的66.01%和69.10%。說明樹脂經(jīng)多次吸附和洗脫后，有一些強(qiáng)吸附性雜質(zhì)成分保留于樹脂床中，降低了樹脂對(duì)欲分離成分的吸附能力。因此，必須對(duì)樹脂進(jìn)行再生處理，除去強(qiáng)吸附成分。

再生情況可視具體情況而定，通常用95%的乙醇洗脫至無色，樹脂柱即已再生，然后以大量水洗脫至滴出液無醇味，即可再用。但若樹脂受污染嚴(yán)重，顏色變深，吸附能力降低，應(yīng)酸堿強(qiáng)化再生處理[16]。

95%乙醇洗脫再生工藝考察：對(duì)已使用過13次的大孔樹脂，先用95%醇浸泡1.5 h，再用95%的乙醇洗脫至滴出液無色，最后用大量水洗脫至無醇味，再重新上樣，考察95%乙醇再生后大孔樹脂柱的吸附容量、解吸率和對(duì)葛根素、總黃酮精制效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

結(jié)果表明：用95%乙醇再生后，樹脂對(duì)葛根素和總黃酮的吸附容量分別可達(dá)到新樹脂的94.35%和91.87%，純度也均可達(dá)到新樹脂的97%以上。且再生后再連續(xù)使用3次，對(duì)兩種指標(biāo)的吸附容量仍在新樹脂的91.70%以上，純度也都在新樹脂的88.90%以上。

3 討論

大孔吸附樹脂能解決其他常用吸附劑難以解決的問題[18]。但使用前對(duì)其預(yù)處理相對(duì)較難，消耗有機(jī)溶劑量大，耗時(shí)較長，因此考察其使用次數(shù)和再生工藝顯得尤為重要。

表1 95%乙醇洗脫再生工藝考察(±s,n=3)Tab.1 Regeneration technology of macroporous resins when treated with 95%ethanol(±s,n=3)

表1 95%乙醇洗脫再生工藝考察(±s,n=3)Tab.1 Regeneration technology of macroporous resins when treated with 95%ethanol(±s,n=3)

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 葛根素比吸率（g/L） 總黃酮比吸率（g/L） 葛根素解吸率（%）總黃酮解吸率（%）葛根素純度（%）總黃酮純度（%）樹脂初次使用 17.29±0.060 46.00±0.21 97.09±0.29 84.81±1.20 32.40±0.08 75.52±0.72連續(xù)使用13次 13.85±0.008 36.69±0.03 93.99±1.21 92.00±0.17 21.15±0.12 52.18±0.19再生后初次使用 16.31±0.0005 42.26±0.02 90.69±1.77 83.20±1.41 31.13±0.35 74.00±0.63再生后第2次使用 16.31±0.0004 42.18±0.03 93.91±0.98 88.20±0.36 29.09±0.27 70.61±0.33再生后第3次使用 16.31±0.0002 42.19±0.03 92.39±1.89 88.08±0.72 28.49±0.76 70.27±1.20

本實(shí)驗(yàn)通過考察HPD-200A型大孔樹脂精制葛根時(shí)的使用次數(shù)和再生工藝，表明新樹脂可連續(xù)使用11次，但為控制精制物的純度，可根據(jù)實(shí)際需要酌情考慮樹脂使用次數(shù)并及時(shí)再生處理。大多數(shù)樹脂的再生需要進(jìn)行酸堿處理[19-21]，此方法需要大量的溶劑，且酸堿的使用存在一定的危險(xiǎn)性。本研究采用乙醇常溫常壓浸泡洗脫法，此法操作簡(jiǎn)便，再生后樹脂的吸附能力和精制效果都基本恢復(fù)至新樹脂水平，且再生后連續(xù)使用3次，樹脂的吸附容量和精致效果均無明顯變化。因此，HPD-200A型大孔樹脂用于精制葛根，新樹脂可連續(xù)使用11次，再生后至少可連續(xù)使用3次，即一批樹脂至少可使用14次，既環(huán)保又能充分節(jié)約成本，本研究可為葛根純化的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考。

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Life and intensified regeneration technology of macroporous resins in extracting and purifying puerarin and total flavonoids from pueraria lobata

LIU Hui-min,DU Shou-ying,LU Yang,LI Peng-yue,FENG Jian-nan
（School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100102,China）

[Objective]To study the life and intensified regeneration technology of HPD-200A macroporous resins in purifying puerarin and puerarin flavonoids.[Methods]With the adsorption capacity and purity of puerarin and total flavonoids as indexes,the absorption capacity of HPD-200A macroporous resins which were multiple absorbed and intensified regenerated was studied.[Results]First,the adsorption capacity of puerarin and total flavonoids was about 17.29 g/L and 46.00 g/L,respectively.Their adsorption capacity became 82.26%and 80.99%of the original and the purity was 27.23%and 67.99%after HPD-200A macroporous resin was used continuously for 11 times.With 95%glycol regeneration,the adsorption capacity of HPD-200A macroporous resins for puerarin and total flavonoids could reach above 94.35%and 91.87%,the purity was more than 97%of the new resin.[Conclusion]With HPD-200A macroporous resin refining puerarin,new resin can be used for 11 times continuously.When regenerated with 95%ethanol,it can be used at least three times again,that is,the HPD-200A resin can be used at least for 14 times.

macroporous resin;puerarin;total flavonoids;regeneration

R285.5

：A

：1672-1519（2014）03-0177-04

2013-10-21）

（本文編輯：高 杉，馬曉輝）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.03.16

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81073057）；北京中醫(yī)藥大學(xué)復(fù)方中藥制劑研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助（2011-CXTD-13）。

劉慧敏（1987－），女，在讀碩士，主要從事中藥新制劑與新技術(shù)研究。

杜守穎，E-mail：dushouying@263.net；陸 洋，E-mail：373940890@qq.com。