李晨龍，賈建偉，李秋偉

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.天津市第二人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合Ⅰ科，天津 300192）

鮮生地（凍干粉）對肝損傷模型大鼠腸生物屏障的影響*

李晨龍1，賈建偉2，李秋偉2

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.天津市第二人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合Ⅰ科，天津 300192）

[目的]探討鮮生地（凍干粉）對肝損傷模型大鼠腸生物屏障的影響。[方法]采用Pringle’s maneuver法制作大鼠肝缺血再灌注損傷模型。將64只實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、鮮生地（凍干粉）組及乳果糖組。觀察大鼠糞便球桿菌比例、菌落培養(yǎng)，測定血清內(nèi)毒素水平。[結(jié)果]鮮生地組、乳果糖組糞便中益生菌增加，大腸桿菌減少，血清內(nèi)毒素水平降低。[結(jié)論]鮮生地能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，降低血內(nèi)毒素水平，可能通過改善腸生物屏障，使肝細胞得到恢復。

鮮生地；肝損傷；生物屏障

中藥生地具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津之功效。鮮生地質(zhì)更潤，清熱涼血、養(yǎng)陰生津作用更強。在之前的鮮生地系列研究中發(fā)現(xiàn)，鮮生地能改善慢性重型肝炎早/中期（營分證）患者腹脹、口干、煩熱等癥狀，降低患者血清內(nèi)毒素（ET）水平，減輕內(nèi)毒素血癥對肝臟的“二次打擊”[1]，并對其降低內(nèi)毒素血癥的機制進行了探討。本研究擬建立大鼠肝損傷模型，以乳果糖為對照，觀察鮮生地（凍干粉）對肝損傷模型大鼠腸生物屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 鮮生地由河南武陟縣采購，真空凍存保鮮，去皮后榨汁制備成凍干粉冷藏備用。乳果糖由北京韓美藥品有限公司提供。內(nèi)毒素測定試劑盒由上海醫(yī)學實驗所提供。雙歧桿菌培養(yǎng)基（TPY）、乳酸桿菌培養(yǎng)基（MRSA）、大腸桿菌培養(yǎng)基（EMB）由北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司提供。

1.2 實驗動物與分組 清潔級SD大鼠64只（天津市山川紅實驗動物科技有限公司提供），體質(zhì)量200～220 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃、濕度55%～65%，每日光照12 h。應用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、鮮生地（凍干粉）組（簡稱鮮生地組）和乳果糖組4組，每組16只，雌雄各半。給藥3 d后造模，手術(shù)前禁食12 h，自由飲水。每日上午9:00和下午4:00，假手術(shù)組、模型組按7.5 mL/kg生理鹽水灌胃，給藥組分別給予7.5 mL/kg相應藥物灌胃，處死前1 d停藥。于24 h、48 h兩個時點各組取8只大鼠，留取標本后處死。

1.3 模型制作 采用Pringle’s maneuver法[2]建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型（HIRI）。腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，經(jīng)上腹正中斜切口，解剖肝—十二指腸韌帶，除假手術(shù)組外，其余組用無創(chuàng)血管夾夾閉第一肝門部（包括肝動脈、門靜脈和膽管）。夾閉期間，間斷向腹腔注射總量約15～20 mL/kg等滲鹽水，以預防或減輕在松開動脈夾后出現(xiàn)的一過性低血容量反應，30 min后取出血管夾，恢復血供。造模成功標志為夾閉后肝臟缺血顏色變深、腫脹，腸管瘀血，顏色變深；松開血管夾恢復血運，肝臟及腸管顏色逐漸恢復。腹部切口縫合。分別于再灌注后24 h、48 h麻醉下腹腔切開，收集結(jié)腸內(nèi)糞便、采集門靜脈血。

1.4 糞便涂片檢測 采用無菌容器留取新鮮糞便，取無菌棉簽挑取糞便以30°～40°角均勻速度推片，面積約1.0 cm×2 cm～1.5 cm×2 cm左右，待自然干燥后固定，行革蘭染色，在100（物鏡）×10（目鏡）倍油鏡下觀察記錄。觀察革蘭陽性桿菌（G+b）、革蘭陰性桿菌（G-b）、革蘭陽性球菌（G+c）、革蘭陰性球菌（G-c）比例。

1.5 細菌培養(yǎng) 采集新鮮糞便標本2份分別置入無菌試管和無氧試管立即送細菌室，取新鮮糞便0.2 g加入0.9 mL的生理鹽水，在振蕩器上使之勻漿，標本按10倍連續(xù)稀釋法至10-9，分別取10-1、10-3、10-5、10-7、10-9稀釋液0.01 mL分別接種于用于選擇性培養(yǎng)基上。選擇具有代表性的大腸桿菌（E.coli）、乳酸桿菌（LB）及雙歧桿菌（BB）的選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。每種稀釋度接種3滴，計數(shù)時取其菌落的平均數(shù)。將MRSA、TPY培養(yǎng)基置入?yún)捬豕拗?，放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋封閉，再放入37℃的孵育箱中培養(yǎng)48h，將EMB培養(yǎng)基直接放在37℃孵育箱中培養(yǎng)24 h，即可完成。結(jié)果以每克糞便濕質(zhì)量中菌落形成單位的對數(shù)值表示（log CFU/g）。每mL標本中活菌集落單位即公式CFU/mL=（標本質(zhì)量+稀釋度）/標本質(zhì)量×稀釋度×菌落個數(shù)（或×10）（稀釋度即稀釋倍數(shù)）。

1.6 ET測定 由大鼠門靜脈取血2mL，用干燥無熱源肝素試管收集血液，1 h內(nèi)分離血清，置于-70℃凍存待測定。采用終點顯色法檢測。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組計量資料的組間比較采用單因素方差分析，多組率的比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 糞便球桿菌比例 一般情況下，大鼠球/桿比約為25∶75（即1∶3），將球/桿比≤1∶3定為比例正常，球/桿比＞1∶3定為比例失調(diào)。實驗結(jié)果顯示，鮮生地組、乳果糖組與模型組比較，球/桿比例失調(diào)的大鼠減少，鮮生地組與乳果糖組比較，球/桿比例失調(diào)例數(shù)無明顯差異。見表1。由于各組大鼠較少，各組間χ2檢驗結(jié)果無統(tǒng)計學差異。

表1 各組大鼠球/桿比例比較Tab.1 Comparison of the ratio between cocci and bacilli in rats’feces 只（%）

2.2 糞便雙歧桿菌、乳酸桿菌及大腸桿菌菌落 與假手術(shù)組比較，模型組大腸桿菌明顯升高，乳酸桿菌、雙歧桿菌減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。鮮生地組、乳果糖組與模型組比較，大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），鮮生地組與乳果糖組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腸道3種細菌的菌落比較（±s）Tab.2 Comparison of three bacterial colonies in each group（±s） log CFU/g

表2 各組大鼠腸道3種細菌的菌落比較（±s）Tab.2 Comparison of three bacterial colonies in each group（±s） log CFU/g

注：假手術(shù)組與模型組比較，**P<0.01；鮮生地組、乳果糖組與模型組比較，*P<0.05。

組別 n 24 h E.coli LB BB假手術(shù)組 8 6.88±0.60 6.96±0.82 2.92±0.38**模型組 8 8.54±0.74 5.65±1.39 2.41±0.50鮮生地組 8 7.89±0.53 7.34±0.89 2.96±0.41*乳果糖組 8 7.85±0.49 7.16±0.60 2.92±0.44*組別 n 48 h E.coli LB BB假手術(shù)組 8 6.82±0.40 6.57±0.73 3.01±0.47**模型組 8 8.23±0.56△5.07±0.91 2.50±0.41鮮生地組 8 7.62±0.33 7.26±1.02 3.01±0.44*乳果糖組 8 7.61±0.6 6.88±1.05 2.94±0.33*

2.3 各組大鼠內(nèi)毒素檢測結(jié)果 模型組大鼠門靜脈血ET含量明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）。鮮生地組、乳果糖組與模型組比較，其含量明顯降低，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。鮮生地組與乳果糖組比較，無統(tǒng)計學差異（P>0.05），見表3。

表3 各組大鼠ET含量比較（±s）Tab.3 Comparion of the ET level in each group（±s）EU/mL

表3 各組大鼠ET含量比較（±s）Tab.3 Comparion of the ET level in each group（±s）EU/mL

注：模型組與假手術(shù)組比較，**P<0.01；鮮生地組、乳果糖組與模型組相比，*P<0.05；鮮生地組與乳果糖組相比。

組別 n 24 h 48 h假手術(shù)組 8 0.056±0.013** 0.049±0.011**模型組 8 0.165±0.011 0.163±0.029鮮生地組 8 0.129±0.013* 0.103±0.007*乳果糖組 8 0.126±0.019* 0.113±0.015*

3 討論

地黃為玄參科植物地黃新鮮或干燥的塊根?，F(xiàn)代藥物成分研究表明[3]：水蘇糖是地黃主要的有效活性成分之一，具有潤腸通便、改善腸道微環(huán)境、增殖雙歧桿菌、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、提高機體免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用。生物屏障為對外來菌株有定植抵抗作用的腸內(nèi)正常寄生菌群。腸道微生物為人體最大的細菌庫，通常情況下，腸道內(nèi)微生物群構(gòu)成一個對抗病原體的重要的保護屏障。當微生態(tài)菌群的穩(wěn)定性遭到破壞后，腸道定植抵抗力大為降低，可導致腸道中潛在性病原體（包括條件致病菌）的定植和入侵，亦可導致腸道內(nèi)毒素大量生成。

慢性肝病時常伴有腸道菌群失調(diào)的發(fā)生，其原因可能與發(fā)病過程中腸蠕動減慢、內(nèi)毒素血癥、腸黏膜水腫、低蛋白血癥等有關(guān)。吳仲文等[4]發(fā)現(xiàn)，慢性重型肝炎患者腸道菌群失調(diào)重于慢性肝炎患者，并認為腸道菌群失調(diào)的程度與肝炎病情嚴重程度相關(guān)。本實驗中觀察大鼠糞便標本中球/桿菌比例及重要菌株菌落計數(shù)等指標，一般不受糞便稀釋或濃縮的影響，其結(jié)果具有較大臨床意義，糞便標本直接涂片革蘭氏染色觀察細菌球/桿比是判斷腸道細菌失調(diào)的一個重要指標[5]。本實驗結(jié)果提示鮮生地、乳果糖在預防和治療腸道菌群失調(diào)方面具有一定的作用。有研究表明，腸道菌群失調(diào)是腸道黏膜生物屏障受損的主要病因臨床應用生地后可增加腸道益生菌，從而利于保護腸黏膜生物屏障改善[6]。

ET是G-細菌外層結(jié)構(gòu)即磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，能夠引發(fā)強烈炎性反應，它是革蘭陰性桿菌致病的啟動因子被認為是肝損傷發(fā)病機制的重要促進因素[7]。肝病患者長期持續(xù)存在的內(nèi)毒素血癥（ETM）[8-9]，可加劇肝細胞損傷，促進肝纖維化過程，在肝炎重癥化與慢性化中起著重要的作用[10-12]。本實驗觀察發(fā)現(xiàn)大鼠肝損傷后，門靜脈血ET水平升高，并顯著高于假手術(shù)組，鮮生地及乳果糖可改善內(nèi)毒素血癥。既往研究已證實鮮生地對腸道機械屏障有保護作用，可能通過機械屏障的保護改善了內(nèi)毒素血癥，本研究證實了鮮生地對生物屏障的調(diào)節(jié)作用，亦進一步表明了鮮生地改善內(nèi)毒素血癥的機制可能包括對腸生物屏障的調(diào)節(jié)。

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Effect of fresh rehmannia(freeze-dried)on intestinal biological barrier in rats with liver injury

LI Chen-long1,JIA Jian-wei2,LI Qiu-wei2
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Department of Integrated Chinese and Western Medicine（Division I）,The Second People’s Hospital of Tianjin,Tianjin 300192,China）

[Objective]To explore the effect of fresh rehmannia (freeze-dried)on intestinal biological barrier in liver damaged rats.[Methods]According to the method of Pringle’s maneuver,hepatic ischemia reperfusion was induced in rats.The 64 rats were randomly divided into sham operation group,model group,fresh rehmannia (freeze-dried)group and the lactulose group.We observed the proportion ratio of coccobacillus in rats’feces,cultured the bacterial colony and measured the level of endotoxin.[Results]In fresh rehmannia group and lactulose group the probiotics was increased,escherichia coli was decreased and the level of endotoxin was decreased.[Conclusion]Fresh rehmannia can regulate the intestinal flora,and reduce blood endotoxin level.It may improve the intestinal biological barrier and recover the liver cells.

fresh rehmannia;liver injury;biological barrier

R285.5

：A

：1672-1519（2014）03-0165-03

2013-09-15）

（本文編輯：馬 英，馬曉輝）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.03.13

天津市衛(wèi)生局科技基金項目（2010kz12）。

李晨龍（1988-），女，在讀碩士,主要從事病毒性肝炎診治研究。

李秋偉，E-mail：shddelqw@126.com。