李 瑤，趙良中，方 芳 (吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院病原教研室，吉林 吉林 132013)

前列腺癌是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，95%以上的前列腺癌是發(fā)生于前列腺腺體組織的腺癌。前列腺癌的發(fā)病率具有明顯的地理和種族差異。2011年美國(guó)前列腺癌新發(fā)病例數(shù)為240 890例，死亡病例數(shù)33 720例，在美國(guó)男性癌癥相關(guān)死因中位居第2。同大部分亞洲國(guó)家一樣，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率并不高，但由于環(huán)境污染及人口老齡化等因素的作用，近年來我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率有明顯的上升趨勢(shì)。前列腺癌常發(fā)生于前列腺的周邊帶，起病較為隱匿，生長(zhǎng)較緩慢，早期前列腺癌可無任何預(yù)兆癥狀，一旦出現(xiàn)癥狀，常屬較晚期的進(jìn)展性前列腺癌，甚至?xí)霈F(xiàn)轉(zhuǎn)移癥狀，導(dǎo)致并發(fā)癥和死亡率的升高[1-3]。因此，早期、合理、高效的診斷方法，對(duì)前列腺癌治療顯得尤為重要。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。RT-qPCR的應(yīng)用范圍很廣泛，包括mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定等[4-5]， RT-qPCR技術(shù)在前列腺癌診斷中亦有應(yīng)用，本文就RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)與前列腺癌關(guān)系較密切的三個(gè)腫瘤標(biāo)志物：前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、α-甲基?；o酶A消旋酶(AMACR)及前列腺癌基因3(PCA3)的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌患者體液中PSMA

PSMA 是一種II型跨膜糖蛋白,人PSMA基因全長(zhǎng)62 035 bp,定位于染色體11P1-P2,分量約為10 000，由前列腺上皮細(xì)胞分泌[6-7]。PSMA是一種多功能蛋白，不僅具有多種蛋白酶活性,參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取及跨膜信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞的內(nèi)化作用[8-9]。前列腺癌早期階段就有癌細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)，外周血中的PSMA mRNA 的檢測(cè)將有助于早期診斷及前列腺癌血行播散的判斷。Beckett ML等[10]運(yùn)用高靈敏度的RT-qPCR方法檢測(cè)PSMA在前列腺癌及其轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)增高，其組織特異性明顯?；颊咄庵苎行滦蚉SMA剪接變異體的檢測(cè)有助于前列腺癌的診斷，采用RT-qPCR方法檢測(cè)新型剪接變異體PSM-E，不僅有助于前列腺癌的診斷，還可以區(qū)分正常前列腺、前列腺增生和前列腺癌[11]。采用RT-qPCR方法檢測(cè)新輔助治療后前列腺癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)抽吸液內(nèi)PSMA mRNA基因表達(dá)，為前列腺癌術(shù)前臨床分期提供可靠的診斷依據(jù)，避免病理檢查難以發(fā)現(xiàn)變性的前列腺癌細(xì)胞，以及影像學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)的病灶[12-13]。尿液中利用RT-qPCR檢測(cè)PSMA是否有意義有待于進(jìn)一步研究。在治療方面，利用構(gòu)建shRNA-PSMA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞株LNCaP，結(jié)果對(duì)PSMA mRNA表達(dá)產(chǎn)生抑制，并且抑制率為60%，為后期研究前列腺癌免疫導(dǎo)向治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。人PSMA基因片段能夠在釀酒酵母中誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行翻譯后糖基化修飾,為抗前列腺癌PSMA疫苗的研制奠定了良好基礎(chǔ)[14-15]。

2 RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌患者體液中的AMACR

AMACR基因定位于5號(hào)染色體5p13.2 q11.1，編碼198～382個(gè)氨基酸殘基的相應(yīng)蛋白，AMACR蛋白存在多種亞型，主要存在于線粒體和過氧化物酶體中。AMACR的優(yōu)點(diǎn)在于它是癌癥特異性，只存在于癌癥組織。AMACR亦可用作其他癌癥的診斷標(biāo)志物。對(duì)各種癌癥細(xì)胞進(jìn)行檢查后發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤都過度表達(dá)AMACR，以結(jié)腸直腸癌和前列腺癌表達(dá)最高[16-18]。尿液中AMACR mRNA的表達(dá)量可以作為前列腺癌診斷的一種非損傷性指標(biāo)，前列腺穿刺活檢前收集前列腺按摩后的尿液，離心后，用RT-qPCR檢測(cè)尿液中AMACR mRNA的含量，其表達(dá)較高，對(duì)前列腺癌的早期診斷有潛在的臨床價(jià)值。同時(shí)利用RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌中AMACR mRNA的表達(dá)，其表達(dá)診斷前列腺癌的敏感度和特異度較高，分別為81.3%和86.7%。然而前列腺癌組織中AMACR mRNA表達(dá)量與不同臨床分期和病理分級(jí)之間關(guān)系則不具有統(tǒng)計(jì)意義[19-20]。Sreekumar等[21]通過蛋白質(zhì)芯片、免疫印跡和ELASA三種技術(shù)方法分別對(duì)前列腺癌患者和對(duì)照組進(jìn)行血清AMACR檢測(cè)，結(jié)果顯示前列腺癌患者血清AMACR濃度明顯高于對(duì)照組。RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌患者血清中的AMACR未見報(bào)道。AMACR mRNA在前列腺組織中的表達(dá)對(duì)前列腺癌的診斷具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。AMACR是對(duì)現(xiàn)有前列腺癌診斷方法的重要補(bǔ)充，AMACR可大大提高前列腺癌的診斷準(zhǔn)確性。

3 RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌患者體液中的PCA3

PCA3基因是1999年bussemakers等發(fā)現(xiàn)的一種前列腺癌特異基因，該基因位于人類染色體9q21-22,全長(zhǎng)約25 kb。Hessels等[22]檢測(cè)了正常腎、膀胱、前列腺等組織及外周血淋巴細(xì)胞中PCA3 mRNA拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除前列腺外，其他組織都為陰性；同時(shí)還對(duì)108例PSA>3 μg/L的患者行前列腺穿刺活檢，用RT-qPCR檢測(cè)前列腺穿刺活檢組織中的PCA3 mRNA，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，癌細(xì)胞數(shù)大于10%的前列腺癌標(biāo)本的PCA3 mRNA拷貝數(shù)是非惡性前列腺組織的66倍。癌細(xì)胞數(shù)少于10%的前列腺癌標(biāo)本的PCA3 mRNA拷貝數(shù)是非惡性前列腺組織的11倍。因此該基因在前列腺癌細(xì)胞中特異性表達(dá)，正常前列腺細(xì)胞，前列腺增生的細(xì)胞中不表達(dá)或者僅少量表達(dá)。Landers等[23]用RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌組織中的PCA3 mRNA表達(dá)，證實(shí)前列腺癌組織中PCA3是良性前列腺增生組織的140倍。由此可見，PCA3特異性高表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞，在正常前列腺或良性前列腺增生組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在其他正常組織、血液或其他腫瘤標(biāo)本中不表達(dá)。Deras等[24]對(duì)570例擬行前列腺穿刺活檢患者進(jìn)行尿液PCA3 mRNA檢測(cè)，定量分析PCA3，其值與前列腺癌活檢陽性率直接相關(guān)。尿液PCA3基因檢測(cè)對(duì)前列腺癌早期診斷及前列腺癌預(yù)后的監(jiān)測(cè)有重要意義。PCA3適合作為前列腺癌特異性標(biāo)志物，在臨床上，用RT-qPCR方法檢測(cè)患者血液、前列腺按摩液、精液或前列腺按摩后尿液，能準(zhǔn)確量化PCA3 mRNA水平，預(yù)測(cè)前列腺穿刺活檢結(jié)果，作為一種非侵入性檢測(cè)方法，能顯著提高前列腺癌診斷的靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性。由于PCA3 mRNA具有較高的敏感性和特異性，這使得有可能在大量正常前列腺細(xì)胞存在的背景下檢測(cè)出少量癌細(xì)胞,也可用于體液如血液、精液、尿液和前列腺按摩液中少量癌細(xì)胞的檢測(cè)。在前列腺癌靶向治療方面，Schalken等[25]研究分析了PCA3啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)積轉(zhuǎn)錄起始因素，發(fā)現(xiàn)PCA3的前列腺癌具有特異性，可致前列腺癌細(xì)胞死亡，而非惡性前列腺細(xì)胞及其他人體正常組織細(xì)胞不受影響。

4 結(jié)語及展望

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，在歐美國(guó)家發(fā)病率極高,在高齡男性僅次于肺癌，在我國(guó)隨著人均壽命的不斷增長(zhǎng),近年發(fā)病率迅速增加。前列腺癌多數(shù)無明顯臨床癥狀,常偶然被發(fā)現(xiàn)，或者在前列腺增生手術(shù)標(biāo)本中被發(fā)現(xiàn)。臨床發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)前列腺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期,失去治療的最佳時(shí)機(jī),并且預(yù)后不良容易復(fù)發(fā)。目前主要用直腸指檢聯(lián)合血清PSA 測(cè)定對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行初步的篩選,然后對(duì)陽性患者進(jìn)行反復(fù)的穿刺活檢,最后才能確診。血清PSA 的水平容易受到多種因素的影響，而且前列腺增生和前列腺炎也可以引起血清PSA 水平的升高，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而導(dǎo)致不必要的穿刺，反復(fù)的穿刺不僅增加病人的痛苦而且可能導(dǎo)致其他并發(fā)癥。因此迫切需要尋找新的前列腺癌特異性的腫瘤標(biāo)志物，以提高前列腺癌診斷的特異性。近年來發(fā)現(xiàn)一些新的主要的前列腺癌腫瘤標(biāo)志物如PCA3、AMACR及PSMA等。PCA3、AMACR及PSMA對(duì)前列腺癌的早期診斷及指導(dǎo)治療具有十分重要的意義，應(yīng)用前景廣闊。三者在前列腺癌診斷，特別是早期診斷中能否成為聯(lián)合檢測(cè)的分子標(biāo)志物，在前列腺癌治療領(lǐng)域里能否根據(jù)基因序列特點(diǎn)，能否設(shè)計(jì)靶向基因疫苗，能否聯(lián)合靶向治療晚期前列腺癌患者，能否可以成為判斷前列腺癌預(yù)后的聯(lián)合指標(biāo)，均有待于進(jìn)一步研究。

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