張振宇，高健剛，姜波，侯四川

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071 1 外科學(xué)專業(yè)； 2 附屬青島市市立醫(yī)院泌尿外科)

前列腺癌目前是美國男性最常見的一種惡性腫瘤，也是最容易導(dǎo)致死亡的惡性腫瘤之一[1]。我國前列腺癌發(fā)病率較低，但近年隨著人口老齡化、生活條件的改善以及診斷技術(shù)的不斷提高,其發(fā)病率有明顯增加的趨勢。最近研究結(jié)果表明，在前列腺組織中存在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞(NEC)，而NEC是全身彌漫性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)即APUD(amine precursor uptake and decarboxylation)細胞系統(tǒng)的組成部分，APUD在前列腺的生長及發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。同樣，前列腺癌組織中也可見大量的神經(jīng)內(nèi)分泌化(NED)現(xiàn)象，且表現(xiàn)得尤為明顯[2]。Galanin及其受體在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布較廣泛，既往文獻報道Galanin蛋白在前列腺惡性腫瘤組織陽性表達率升高，對前列腺癌的診斷具有一定意義[3-4]。Galanin 2型受體(GalR2)廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)及許多外周組織如輸精管、前列腺、子宮、卵巢等，參與腫瘤進展及生長中細胞增殖過程[5-6]。CHUNG等[7]研究顯示，前列腺癌組織中編碼GalR2基因的甲基化水平明顯升高，提示GalR2可能在前列腺癌組織中表達異常。目前GalR2在前列腺癌組織表達方面的研究國內(nèi)尚未見報道，為此，本研究采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測前列腺增生(BPH)及前列腺癌組織中Galanin及GalR2的表達，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集青島市市立醫(yī)院東院區(qū)2010年10月—2013年5月確診的50例BPH、50例未轉(zhuǎn)移前列腺癌(PCa)及30例發(fā)生骨轉(zhuǎn)移前列腺癌(BM)的石蠟標(biāo)本。其中BPH病人的年齡為62～78歲，平均69歲；前列腺癌病人年齡為56～83歲，平均71歲。PCa組病例經(jīng)診斷未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移，其中有27例為根治性切除標(biāo)本，23例為經(jīng)直腸穿刺標(biāo)本。BM組均為經(jīng)直腸穿刺標(biāo)本，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)骨組織受累。

1.2 免疫組化檢測方法

石蠟切片脫蠟和水化。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗3次，除去PBS，在高壓鍋中進行高溫高壓抗原修復(fù)(0.01 mol/L檸檬酸抗原修復(fù)液7 mL)，噴氣后計時2 min，自然冷卻。用PBS沖洗3次，除去PBS，每張切片滴加體積分數(shù)0.03過氧化氫溶液覆蓋標(biāo)本，室溫培養(yǎng)10 min。PBS沖洗3次，加牛血清，室溫孵育30 min。甩去血清，滴加一抗，置4 ℃恒溫冰箱中培養(yǎng)12 h。PBS沖洗3次，滴加二抗，室溫孵育10 min。PBS沖洗3次，滴加DAB緩沖液覆蓋標(biāo)本約5～10 min，光鏡下觀察染色程度。蘇木精復(fù)染，脫水干燥，封固，光鏡下觀察。Galanin及GalR2抗體購自美國Abcam試劑公司，即用型快速免疫組化檢測試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，Galanin和GalR2相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Galanin蛋白的表達

Galanin免疫組織化學(xué)染色顯示，前列腺癌細胞胞漿中可見大量著黃褐色的顆粒，而在BPH細胞胞漿中Galanin則為低表達或表達缺失。Galanin在PCa組、BM組和BPH組中的陽性表達率分別為68.0%(34/50)、83.3%(25/30)和18.0%(9/50)，PCa組和BM組Galanin的陽性表達率均顯著高于BPH組(χ2=25.50、32.75,P<0.01)，但PCa組與BM組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 GalR2蛋白的表達

GalR2免疫組織化學(xué)染色顯示，BPH細胞胞膜上可見大量著黃褐色的顆粒，而在前列腺癌細胞的胞膜中GalR2則為低表達或表達缺失。GalR2蛋白在BPH組、PCa組、BM組中的陽性表達率分別為80.0%(40/50)、14.0%(7/50)和6.7%(2/30)，BPH組GalR2蛋白陽性表達率顯著高于PCa組和BPH組(χ2=43.72、40.43，P<0.01)，但是PCa組與BM組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 Galanin與GalR2蛋白在前列腺癌組織表達的相關(guān)性

在50例PCa組織中，Galanin表達陽性34例，GalR2表達陽性7例，二者均不表達9例；在30例BM組織中，Galanin表達陽性25例，GalR2表達陽性2例。Galanin與GalR2蛋白在PCa組和BM組中的表達均呈顯著負相關(guān)(rs=-0.55、-0.77，P<0.01)。

3 討 論

目前，前列腺癌的主要治療方法有體外放射、近距離照射、局部治療、內(nèi)分泌治療及根治性前列腺切除術(shù)等。內(nèi)分泌治療(如手術(shù)和藥物去勢、雄激素受體拮抗劑及其他抗雄激素藥物等)是晚期前列腺癌的主要治療措施，大多數(shù)病人在疾病早期采取內(nèi)分泌治療有效，但病程在14～30個月后療效可能不佳，這種情況可認為前列腺癌已經(jīng)發(fā)展為激素非依賴型。另有少數(shù)病人發(fā)現(xiàn)前列腺癌的時間較晚，或已出現(xiàn)全身轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)時即為激素非依賴型前列腺癌，內(nèi)分泌治療對于這類病人療效不佳，許多研究認為此情況與前列腺癌NED有關(guān)[8]。

Galanin最早是從牛的消化系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)、分離的，它是一種神經(jīng)多肽，在遞質(zhì)釋放、攝食、疼痛、生殖、睡眠及覺醒等生理功能的調(diào)節(jié)中起作用[3]。目前,國內(nèi)外已有研究顯示，在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中存在Galanin及其相關(guān)受體表達，如成神經(jīng)細胞瘤及垂體腫瘤；Galanin對腦組織中進行的有絲分裂具有促進作用，因此提示其在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤生長及進展過程中可能參與細胞增殖過程。Galanin有3種受體，分別是GalR1、GalR2和GalR3，Galanin主要是通過這3種受體的介導(dǎo)發(fā)揮作用[3]。目前3種GalR都已在人神經(jīng)細胞腫瘤組織被檢測出來[9]，而在其他腫瘤各種GalR表達存在很大差異。GalR2可能同時擁有促增殖和抗增殖的作用，GalR2被證實在早期小細胞肺癌組織有促增殖作用[10]；最近的研究表明，GalR2在神經(jīng)母細胞瘤、嗜鉻細胞瘤和頭頸部鱗狀細胞癌組織表達導(dǎo)致了細胞增殖的抑制[11-13]。GalR2在神經(jīng)系統(tǒng)的增殖和凋亡方面有重要作用,但其在非神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的信號機制和功能卻是相對未知的[10]。 MISAWA等[14]報道，在頭頸部鱗癌細胞株中GalR2蛋白表達水平降低，而非腫瘤細胞中其表達水平穩(wěn)定；在臨床組織標(biāo)本中，GalR2基因啟動子的甲基化水平升高，且與病人無病生存期呈負相關(guān)，提示GalR2可能抑制腫瘤的生長，且在腫瘤的靶向治療及預(yù)后等方面具有研究潛力。

本研究結(jié)果顯示，前列腺癌組織中Galanin蛋白表達水平較高，而在BPH組織中其表達較低；相反，BPH組織中GalR2蛋白表達水平較高，而在前列腺癌組織中其表達較低；Galanin與GalR2蛋白在前列腺癌組織中的表達呈顯著負相關(guān)。以上結(jié)果提示，在前列腺惡性腫瘤組織中，Galanin蛋白表達持續(xù)升高，而GalR2的表達降低或缺失；在BPH組織中，兩種蛋白的表達情況剛好與惡性腫瘤相反。Galanin蛋白在前列腺癌組織中的表達情況與既往報道結(jié)果相似[4]，提示Galanin可能參與了前列腺癌的發(fā)病機制，對前列腺癌的診斷有一定臨床意義。而GalR2蛋白在前列腺癌組織中表達水平降低，與Galanin蛋白表達水平呈負相關(guān)，提示Galanin在前列腺癌組織可能是通過與GalR2之外的兩種受體相結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)作用，也提示Galanin與GalR2蛋白的聯(lián)合檢測對前列腺良惡性病變的診斷具有較好的臨床意義。本研究的不足之處在于，Galanin蛋白在前列腺癌組織的表達升高，是否通過上調(diào)GalR1和(或)GalR3蛋白的表達發(fā)揮作用目前尚不明確，仍需進一步的研究。

綜上所述，Galanin和GalR2對良惡性前列腺腫瘤的鑒別及預(yù)測前列腺癌預(yù)后有一定的意義。然而，細胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白間相互作用是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，本文結(jié)果仍需進一步擴大樣本量后在多個相關(guān)受體基因及蛋白水平的研究中進行驗證、明確。

[參考文獻]

[1] SCHRODER F H. Prostate cancer around the world. An overview[J]. Urol Oncol, 2010,28(6):663-667.

[2] HANSSON J, ABRAHAMSSON P A. Neuroendocrine differentiation in prostatic carcinoma[J]. Scand J Urol Nephrol Suppl, 2003(212):28-36.

[3] RAUCH I, KOFLER B. The galanin system in cancer[J]. EXS, 2010,102:223-241.

[4] 孫延波,孫小慶,高健剛,等. 加蘭肽在前列腺癌組織中的表達及其意義[J]. 腫瘤研究與臨床, 2012,24(11):758-759,762.

[5] BRANCHEK T A, SMITH K E, GERALD C, et al. Galanin receptor subtypes[J]. Trends Pharmacol Sci, 2000,21(3):109-117.

[6] MITSUKAWA K, LU X, BARTFAI T. Galanin, galanin receptors, and drug targets[J]. Cell Mol Life Sci, 2010,102(12):7-23.

[7] CHUNG W, KWABI-ADDO B, ITTMANN M, et al. Identification of novel tumor markers in prostate, colon and breast cancer by unbiased methylation profiling[J]. PLoS One, 2008,3(4):e2079.

[8] PUCCETTI L, SUPURAN C T, FASOLO P P, et al. Skewing towards neuroendocrine phenotype in high grade or high stage androgen-responsive primary prostate cancer[J]. Eur Urol, 2005,48(2):215-221,223.

[9] PEREL Y, AMREIN L, DOBREMEZ E, et al. Galanin and galanin receptor expression in neuroblastic tumours: correlation with their differentiation status[J]. Br J Cancer, 2002,86(1):117-122.

[10] WITTAU N, GROSSE R, KALKBRENNER F, et al. The galanin receptor type 2 initiates multiple signaling pathways in small cell lung cancer cells by coupling to G(q), G(i) and G(12) proteins[J]. Oncogene, 2000,19(37):4199-4209.

[11] BERGER A, LANG R, MORITZ K, et al. Galanin receptor subtype GalR2 mediates apoptosis in SH-SY5Y neuroblastoma cells[J]. Endocrinology, 2004,145(2):500-507.

[12] KANAZAWA T, KOMMAREDDI P K, IWASHITA T, et al. Galanin receptor subtype 2 suppresses cell proliferation and induces apoptosis in p53 mutant head and neck cancer cells[J]. Clin Cancer Res, 2009,15(7):2222-2230.

[13] TOFIGHI R, JOSEPH B, XIA S, et al. Galanin decreases proliferation of PC12 cells and induces apoptosis via its subtype 2 receptor (GalR2)[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(7):2717-2722.

[14] MISAWA Y, MISAWA K, KANAZAWA T, et al. Tumor suppressor activity and inactivation of galanin receptor type 2 by aberrant promoter methylation in head and neck cancer[J]. Cancer, 2014,120(2):205-213.