劉清，楊靜，聞向梅，林江，陳芹，錢軍

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1．血液科，2．中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

急性髓系白血病骨髓單個核細胞EphrinB2基因表達及其臨床意義

劉清1，楊靜1，聞向梅2，林江2，陳芹2，錢軍1

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院1．血液科，2．中心實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：探討急性髓系白血?。╝cutemyeloid leukemia，AML）患者骨髓EphrinB2基因的表達情況并分析其臨床意義。方法：應(yīng)用實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RQ-PCR）技術(shù)檢測91例AML患者（觀察組）及32例非惡性血液病患者（對照組）骨髓單個核細胞標(biāo)本的EphrinB2表達水平。結(jié)果：AML患者中EphrinB2表達水平比對照組明顯下調(diào)（P＜0．01）。EphrinB2表達水平與AML患者的性別、外周血白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白含量、FAB分型及核型分組之間均無相關(guān)性（P＞0．05），但低表達患者的年齡明顯低于高表達患者（P＝0．011）。接收者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析表明，ROC曲線下面積0．812（95%CI：0．726～0．898；P＜0．01）及0．776（95%CI：0．670～0．883；P＜0．01）可分別用于區(qū)分AML患者與對照組及細胞遺傳學(xué)正常的AML患者與對照組。EphrinB2低表達組患者與高表達組患者的化療后完全緩解率及總生存時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論：EphrinB2表達下調(diào)是AML患者中的一個常見分子事件，但對患者預(yù)后并無明顯影響。

EphrinB2；急性髓系白血病；表達

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia， AML）是髓系祖細胞在發(fā)育過程中受阻于分化成熟的某一定階段，使克隆性白血病細胞因增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他組織和器官，同時導(dǎo)致正常造血受抑制。AML發(fā)病涉及多個基因的突變、缺失、重復(fù)、易位等，基因組異常在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。因此，尋找更多與AML發(fā)生發(fā)展相關(guān)的異常分子是目前臨床與基礎(chǔ)研究的一個重要方向。我們應(yīng)用實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RQ-PCR）方法測定32例非惡性血液病患者和91例AML患者骨髓單個核細胞中EphrinB2的表達水平，以了解EphrinB2在AML中的臨床意義。

1 材料和方法

1．1 病例

91例AML病例為2005年5月至2014年3月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院住院治療的患者，其中男48例，女43例，年齡15～87歲（中位55歲），診斷分型按FAB和WHO 2008版標(biāo)準(zhǔn)［1－2］。治療方案參照以前的報道［3］?；颊咧饕呐R床表現(xiàn)和實驗室特征如表1。對照組32例中，3例為特發(fā)性血小板紫癜，29例為缺鐵性貧血。

1．2 細胞系及細胞培養(yǎng)

7種人白血病細胞株分別為SHI-1、THP-l、HL-60、HEL、NB4、U937和K562。細胞培養(yǎng)的方法：以1×106／mL的密度置于細胞培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1．3 骨髓單個核細胞（BMMNC）分離、RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

骨髓穿刺時抽取骨髓10 mL，肝素抗凝，使用Ficoll密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞。應(yīng)用Trizol一步法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀測定RNA濃度及純度［D（260 nm）／D（280 nm）比值1．8～2．0］，－80℃保存?zhèn)溆谩?．0μg總RNA經(jīng)隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，總體系40μL，其中含25 U RNA酶抑制劑（RNAsin）、10 mmol／L還原劑（DTT）、0．5 mmol／L dNTPs、200 U反轉(zhuǎn)錄酶（MMLV，美國MBI Fermentas公司）；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為25℃10 min、42℃60 min，cDNA儲存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1．4 RQ-PCR檢測EphrinB2的表達量

應(yīng)用Primer Premier 5．0軟件設(shè)計引物，EphrinB2引物序列上游：5′-TCTTTGGAGGGCCTGGATAA-3′，下游：5′-CGTCTGTGCTAGAACCTGGATT-3′，擴增片段長度208 bp；內(nèi)參為ABL管家基因，其上游引物為5′-TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA-3′，下游引物為5′-TCCAACGAGCGGCTTCAC-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。25μL PCR反應(yīng)體系中含1×緩沖液2．5 mmol／L、dNTP 0．5 mmol／L、MgCl24．0 mmol／L、熒光染料（20×EvaGreen）1．2μL、上下游引物1．0μmol／L、熒光定量PCR參比染料（50×Rox）0．8μmol／L、cDNA 50 ng和DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase，MBIFermentas，USA）1．0 U。反應(yīng)在ABI 7300擴增儀（ABI公司）上進行，擴增條件為94℃預(yù)變性4 min、94℃變性30 s、66℃退火30 s、72℃延伸30 s、82℃收集熒光30 s，共40個循環(huán)，熔解曲線程序為95℃15 s、60℃60 s、95℃15 s、60℃15 s。每次擴增均以重組EphrinB2質(zhì)粒為陽性對照，以雙蒸水作為無模板對照（NTC）。熔解曲線揭示PCR產(chǎn)物為單一峰，2%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物長度，結(jié)果顯示正確。隨機選取2例PCR產(chǎn)物進行測序證實序列正確。

1．5 陽性模板與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將1例AML患者的ABL及EphrinB2表達的定性PCR擴增產(chǎn)物克隆進入PGEM-T載體，擴增后進行純化回收，連接過夜后重組載體，提取質(zhì)粒，測序鑒定（上海生工生物工程公司）完全正確，分別將其定量；從108拷貝／μL開始進行10倍稀釋，建立陽性模板梯度后分別進行RQ-PCR擴增，繪制陽模標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取EphrinB2與ABL表達ΔCT值最小的1例對照標(biāo)本作為對照。EphrinB2基因表達采用如下公 式：；PCR擴增效率E＝10（－1／斜率）；ΔCT指對照與標(biāo)本之間EphrinB2和ABL循環(huán)閾值（CT）的差異。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17．0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。連續(xù)性變量之間的差異分析使用Mann-Whitney U檢驗（兩組比較）或Kruskal-Wallis（多組間比較），分類變量之間的差異比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；EphrinB2表達與臨床資料之間的相關(guān)性分析采用Spearman秩和檢驗；生存時間與生存分析采用Kaplan-Meier法；EphrinB2表達在AML中的診斷價值采用接收者操作特征曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）進行評價；P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 AML患者和各細胞系中EphrinB2的表達

EphrinB2在7個白血病細胞系中均存在陽性表達（0．001～1．421），在HL-60和HEL細胞系中EphrinB2轉(zhuǎn)錄本表達陽性率較高。EphrinB2在AML患者、7個白血病細胞系及正常對照組中的表達水平，RQ-PCR產(chǎn)物的典型凝膠電泳結(jié)果見圖1。EphrinB2在AML中的表達（0～1．725，中位數(shù)為0．020）明顯低于對照組（0～7．131，中位數(shù)為0．194，P＜0．01）。見圖2。

2．2 EphrinB2表達的診斷意義

采用ROC曲線評估EphrinB2表達是否可以作為潛在的AML診斷標(biāo)志，結(jié)果顯示EphrinB2表達水平能有效鑒別AML和對照組，ROC曲線下面積為0．812（95%CI：0．726～0．898，P＜0．01）。以0．054為臨界值，通過EphrinB2診斷AML的靈敏度和特異性分別為71．7%和75．8%。此外，ROC曲線顯示EphrinB2表達水平同樣能夠有效區(qū)分正常核型AML患者和對照組（AUC＝0．776，95%CI：0．670～0．883，P＜0．01）。見圖3。

2．3 AML的臨床和實驗室特點

以相對定量0．054為界值，將32例對照組標(biāo)本和91例AML標(biāo)本分成低表達組和高表達組。對照組中低表達陽性率為18．8%（6／32），AML標(biāo)本低表達組陽性率為72．5%（66／91），兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝28．21，P＜0．01）。使用該臨界值對EphrinB2表達水平進行分組統(tǒng)計，結(jié)果顯示EphrinB2表達水平與AML患者的性別、外周血白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)及血紅蛋白含量之間均無相關(guān)性（P＞0．05），但低表達患者的年齡明顯低于高表達患者（P＝0．011）；在FAB分型中，EphrinB2表達頻率依次為M4（60．0%，12／20）、M5（66．7%，4／6）、M2（75．6%，31／41）、M3（76．5%，13／17）、M1（85．7%，6／7），各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝31．27，P＝0．666）；不同核型分組之間EphrinB2表達無明顯差異且不同核型AML患者間EphrinB2轉(zhuǎn)錄本表達也無明顯差異（表1）。

2．4 EphrinB2表達與AML患者預(yù)后之間的關(guān)系

EphrinB2低表達組患者化療后完全緩解（complete remission，CR）率稍高于高表達組患者（分別為48%和39%），但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0．555，P＞0．05）。除去M3的患者，74例患者具有隨訪資料，EphrinB2高表達的總體生存時間較EphrinB2低表達患者短（中位數(shù)分別為6個月和7個月），但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。此外，除去M3后的細胞遺傳學(xué)正常的AML患者EphrinB2高表達的總體生存時間較EphrinB2低表達患者的短（中位數(shù)分別為8個月和11個月），但差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。見圖4。

3 討論

EphrinB是酪氨酸激酶超家族受體Eph的配體中的一員。EphrinB2基因定位于人類13號染色體q33，在許多惡性腫瘤中呈高表達，且與腫瘤血管的生成密切相關(guān)，在惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起著重要作用［4］。近年來的研究表明，EphrinB2在多種實體腫瘤中表達上調(diào)，包括肝癌［5］、膠質(zhì)瘤［6］、鼻咽癌［7］、非小細胞肺癌［8］、頭頸部鱗癌［9］、宮頸癌［10］、子宮內(nèi)膜癌［11］、卡波氏肉瘤［12］、卵巢癌［13］等，但在血液系統(tǒng)惡性疾病中研究甚少。Pennisi等［14］發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者的間充質(zhì)干細胞及溶骨性病變處的骨細胞中EphrinB2表達明顯下調(diào)、EphrinB2-Fc抗體可促進血管新生但并不影響骨髓瘤生長。Kuang等［15］則發(fā)現(xiàn)部分急性淋巴細胞白血病（ALL）原代細胞或細胞株中存在EphrinB2表達降低，與啟動子過甲基化密切相關(guān)。我們的結(jié)果表明AML患者中同樣存在著EphrinB2表達下降，提示EphrinB2表達改變在實體瘤和造血系統(tǒng)腫瘤中可能發(fā)揮著不同的作用。

鑒定具有診斷、輔助診斷、預(yù)后判斷和分層治療指導(dǎo)價值的新標(biāo)志一直是腫瘤臨床研究的一個重要方向。我們通過ROC曲線發(fā)現(xiàn)EphrinB2表達水平檢測對于區(qū)分AML和對照具有良好的靈敏度和特異性，為AML患者尤其是正常核型AML患者提供了鑒別診斷和疾病隨訪的分子標(biāo)志。此外，我們的結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)EphrinB2表達下調(diào)與除了年齡之外的其他指標(biāo)之間的相關(guān)性。

既往的研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤［6］、頭頸部鱗癌［9］、宮頸癌［10］、子宮內(nèi)膜癌［11］和卵巢癌［13］患者中EphrinB2過表達者預(yù)后不良。目前關(guān)于造血腫瘤中EphrinB2表達異常的臨床研究甚少，Kuang等［15］發(fā)現(xiàn)Eph和Ephrin基因家族中發(fā)生甲基化的基因數(shù)量與ALL患者的生存時間呈負相關(guān)。但我們的初步結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)EphrinB2表達水平對AML患者的治療反應(yīng)和預(yù)后具有判斷價值。當(dāng)然，需要更多的病例以及前瞻性臨床試驗來進一步明確EphrinB2表達對預(yù)后的影響。

綜上所述，我們的結(jié)果顯示EphrinB2表達下調(diào)是AML患者中的一個常見分子事件，但對患者的預(yù)后并無明顯影響；檢測EphrinB2表達可用于AML患者的輔助診斷。

［1］ Swerdlow SH，Campo E，Harris NL，et al．WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues［M］．Lyon France：IARC Press，2008．

［2］ Bennett JM，Catovsky D，Daniel MT，et al．Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukaemia．A reportof the French-American-British Cooperative Group［J］．Ann Intern Med，1985，103（4）：620－625．

［3］ Li Y，Lin J，Yang J，etal．Overexpressed let-7a-3 is associated with poor outcome in acutemyeloid leukemia［J］．Leuk Res，2013，37（12）：1642－1647．

［4］ 蔡學(xué)海，趙玉斌，張少華，等．子宮內(nèi)膜癌組織EphB4和EphrinB2蛋白表達臨床意義的研究［J］．中華腫瘤防治雜志，2011，18（10）：787－790．

［5］ Zhu XL，Chen P，Guo H，et al．Relationships among differentiation degree，contrast-enhanced ultrasound and the expression of Ephb4／Ephrinb2 in primary hepatocarcinoma［J］．Hepatogastroenterology，2012，59（116）：1164－1167．

［6］ Tu Y，He S，F(xiàn)u J，et al．Expression of EphrinB2 and EphB4 in glioma tissues correlated to the progression of glioma and the prognosis of glioblastoma patients［J］．Clin Transl Oncol，2012，14（3）：214－220．

［7］ 張潤濤，趙玉斌，張少華，等．鼻咽癌中EphrinB2與VEGF的表達及臨床意義［J］．臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2013，27（4）：178－180．

［8］ 熊曾，劉進，康周，等．非小細胞肺癌組織中EphB4和ephrinB2的表達與CT肺灌注成像的關(guān)系［J］．中國腫瘤雜志，2011，33（3）：192－196．

［9］ Yavrouian EJ，Sinha UK，Rice DH，et al．The significance of EphB4 and EphrinB2 expression and survival in head and neck squamous cell carcinoma［J］．Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2008，134（9）：985－991．

［10］ Alam SM，F(xiàn)ujimoto J，Jahan I，et al．Coexpression of EphB4 and ephrinB2 in tumor advancement of uterine cervical cancers［J］．Gynecol Oncol，2009，114（1）：84－88．

［11］ Alam SM，F(xiàn)ujimoto J，Jahan I，et al．Overexpression of ephrinB2 and EphB4 in tumor advancement of uterine endometrial cancers［J］．Ann Oncol，2007，18（3）：485－490．

［12］ Scehnet JS，Ley EJ，Krasnoperov V，et al．The role of Ephs，Ephrins，and growth factors in Kaposi sarcoma and implications of EphrinB2 blockade［J］．Blood，2009，113（1）：254－263．

［13］ Alam SM，F(xiàn)ujimoto J，Jahan I，et al．Coexpression of EphB4 and ephrinB2 in tumour advancement of ovarian cancers［J］．Br JCancer，2008，98（4）：845－851．

［14］ Pennisi A，LingW，Li X，etal．The ephrinB2／EphB4 axis is dysregulated in osteoprogenitors from myeloma patients and its activation affectsmyeloma bone disease and tumor growth［J］．Blood，2009，114（9）：1803－1812．

［15］ Kuang SQ，Bai H，F(xiàn)ang ZH，et al．Aberrant DNA methylation and epigenetic inactivation of Eph receptor tyrosine kinases and ephrin ligands inacute lymphoblastic leukemia［J］．Blood，2010，115（12）：2412－2419．

Expression of EphrinB2 gene and its clinical significance in acutem yeloid leukem ia

LIU Qing1，YANG Jing1，WEN Xiang-mei2，LIN Jiang2，CHEN Qin2，QIAN Jun1
（1．Department of Hematology，2．Laboratory Center，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the expression of EphrinB2 gene and analyze its clinical significance in acute myeloid leukemia（AML）．M ethods：Real-time quantitative PCR（RQ-PCR）technique was used to examine EphrinB2 expression level in the bonemarrow mononuclear cells from 91 AML patients and 32 non-malignant hematologic patients．Results：EphrinB2 level in AML patients was significantly down-regulated compared to controls（P＜0．01）．There was no correlation between the level of EphrinB2 transcript and the sex，blood parameters，F(xiàn)AB subtypes and cytogenetic risks（P＞0．05），but the age of low expressed patientswas significantly lower than those high expressed patients（P＝0．011）．Receiver operating characteristic curve（ROC）analysis revealed that an areas under the ROC curve of 0．812（95% CI：0．726－0．898；P＜0．01）or 0．776（95%CI：0．670－0．883，P＜0．01）in discriminating AML patients or cytogenetically normal AML patients from controls，respectively．There was no significant difference in the rate of complete remission and overall survival between the groupswith low and high EphrinB2 expression（P＞0．05）．Conclusion：Decreased EphrinB2 expression is a common molecular event in cases with AML but has no impact on the prognosis of patients．

EphrinB2；acutemyeloid leukemia；expression

R733．71

A

1671－7783（2014）05－0389－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140209

國家自然科學(xué)基金資助項目（81270630，81172592）；江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項基金資助項目（BL2012056）；江蘇省“333工程”科研項目資助計劃（BRA2011085，BRA2013136）；鎮(zhèn)江市醫(yī)學(xué)重點人才、鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項目（SH2013042，SH2013082）；江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金資助項目（JLY20120013，JLY20120011）

劉清（1986—），女，碩士研究生；錢軍（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：qianjun0007＠sina．com

2014－07－15 ［編輯］ 陳海林