張凱，劉鷺，程建平，金躍，張建明

（淮安市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇淮安223002）

電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶的方法學(xué)性能驗(yàn)證

張凱，劉鷺，程建平，金躍，張建明

（淮安市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇淮安223002）

目的：建立電化學(xué)發(fā)光法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）方法學(xué)性能驗(yàn)證的方案。方法：應(yīng)用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）文件推薦的方法，通過(guò)羅氏Cobas E601免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)血清NSE值，對(duì)其準(zhǔn)確度、精密度、分析測(cè)量范圍、分析靈敏度和生物參考范圍進(jìn)行性能驗(yàn)證。結(jié)果：NSE準(zhǔn)確度以相對(duì)偏倚表示，為2%～4%，批內(nèi)變異系數(shù)＜1．0%，批間變異系數(shù)＜2．5%，分析靈敏度＜0．05 ng／mL，分析測(cè)量范圍為1．01～351．00 ng／mL，參考范圍為0．0～16．7 ng／mL。結(jié)論：ECLIA法檢測(cè)血清NSE性能參數(shù)和廠商聲明一致，其性能可以滿足臨床要求，驗(yàn)證方案簡(jiǎn)便易行。

電化學(xué)發(fā)光；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；方法學(xué)驗(yàn)證

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）于2003年頒布了《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的專用要求》（ISO 15189）作為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)設(shè)備、檢測(cè)系統(tǒng)或者方法的主要分析性能進(jìn)行驗(yàn)證或確認(rèn)，證實(shí)其能夠達(dá)到所要求的性能標(biāo)準(zhǔn)?！夺t(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》也明確提出，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)姆椒▽W(xué)驗(yàn)證以保證各項(xiàng)參數(shù)符合臨床使用需求。血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）是我科應(yīng)用羅氏Cobas E601免疫分析系統(tǒng)的電化學(xué)發(fā)光法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）檢測(cè)的新項(xiàng)目，根據(jù)ISO 15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)、美國(guó)《臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)法規(guī)修正案》（CLIA′88）、衛(wèi)生部《三級(jí)綜合醫(yī)院評(píng)審標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施細(xì)則》、《醫(yī)院檢驗(yàn)科管理規(guī)范》等管理文件要求，檢測(cè)分析系統(tǒng)在應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室之前，必須對(duì)其主要的分析性能包括變異系數(shù)（CV，即不精密度）、不準(zhǔn)確度（偏倚）、分析測(cè)量范圍、分析靈敏度和生物參考范圍等主要指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。因此，我科對(duì)其進(jìn)行了多項(xiàng)參數(shù)驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料1．1．1 儀器與試劑 Cobas E601全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（瑞士羅氏公司），羅氏配套試劑（鏈霉親和素包被的微粒、生物素化抗NSE單克隆抗體、三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗NSE單克隆抗體）、校準(zhǔn)品以及質(zhì)控品。

1．1．2 標(biāo)本 高或低濃度NSE血清樣本來(lái)自我院常規(guī)檢測(cè)患者，參考范圍驗(yàn)證所用血清樣本來(lái)自我院健康體檢者（血常規(guī)和常規(guī)生化體檢結(jié)果正常），男、女各20例，平均年齡（35．5±6．8）歲，其中女性排除月經(jīng)和妊娠，所有標(biāo)本均無(wú)溶血，收集時(shí)間為2014年3月。

1．2 方法

1．2．1 樣本檢測(cè) 按Cobas E601操作規(guī)程對(duì)儀器進(jìn)行系統(tǒng)維護(hù)保養(yǎng)，室內(nèi)質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果在控后，按項(xiàng)目說(shuō)明書(shū)要求收集空腹靜脈血液并分離血清，將血清與質(zhì)控品、校準(zhǔn)品或樣本稀釋液等按檢測(cè)程序進(jìn)行檢測(cè)。

1．2．2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（clinical and laboratory standards institute，CLSI）EP9-A2文件，用羅氏校準(zhǔn)品（LOT：00169337，濃度為11．3 ng／mL和82．0 ng／mL），先對(duì)分析系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)校準(zhǔn)；再按程序檢測(cè)校準(zhǔn)品，重復(fù)檢測(cè)3次求平均值，將所得驗(yàn)證值與靶值進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算二者間的相對(duì)偏倚，如偏倚在±20%之內(nèi)則驗(yàn)證合格［1］。1．2．3 精密度驗(yàn)證 參考EP5-A文件，選擇羅氏公司的質(zhì)控血清（PC TM1：LOT 16995700；PC TM2：LOT 16995800）作為精密度驗(yàn)證樣本，按NSE樣本檢測(cè)程序進(jìn)行測(cè)定，每天重復(fù)3次，持續(xù)5 d，進(jìn)行批內(nèi)與批間精密度驗(yàn)證，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)［2］。批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（Sr）和批間標(biāo)準(zhǔn)差（Sb）D是總天數(shù)（即5 d），d是每天測(cè)定結(jié)果的平均值，n是每天重復(fù)測(cè)定總次數(shù)（即3次），i是次數(shù)，1次，2次或3次是每天重復(fù)測(cè)定的結(jié)果，是每天所有檢測(cè)結(jié)果的平均值是所有5天的和除以總的天數(shù)。

1．2．4 分析測(cè)量范圍（analyticalmeasurement range，AMR）驗(yàn)證 按CLSI EP6-A2文件，選擇2份檢測(cè)NSE的患者血清，分別為低濃度（L，1．01 ng／mL）和高濃度（H，351．0 ng／mL），按5L、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、5H的比例關(guān)系配制成6份不同濃度的混合血清，每份血清重復(fù)檢測(cè)3次取平均值，對(duì)6份系列濃度混合血清樣本的檢測(cè)平均值與預(yù)期值進(jìn)行多項(xiàng)式回歸統(tǒng)計(jì)，比較實(shí)測(cè)值（Y）與預(yù)期值（X），計(jì)算回歸方程后確定NSE的線性范圍［3］。

1．2．5 分析靈敏度驗(yàn)證 參考文獻(xiàn)［4］，以Elecsys通用稀釋液作為空白樣品測(cè)定20次，記錄每次發(fā)光強(qiáng)度值和濃度值，如超過(guò)空白檢測(cè)限（Limit of blank，LoB）的值不超過(guò)3個(gè)，則給出的LoB值可用［4］。

1．2．6 生物參考范圍驗(yàn)證 采集2014年3月在我院體檢中心體檢者（常規(guī)生化與血常規(guī)體檢均正常）空腹血清，男女各20例，按檢測(cè)程序進(jìn)行檢測(cè)，要求不超過(guò)10%數(shù)據(jù)（即不多于4個(gè)）在廠商給的生物參考范圍之外，否則NSE的生物參考范圍需重新建立［5］。

1．3 統(tǒng)計(jì)分析

準(zhǔn)確度、精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)計(jì)算與處理采用Office 2010 Excel軟件。AMR驗(yàn)證應(yīng)用SPSS 18．0軟件統(tǒng)計(jì)分析處理，采用多項(xiàng)式回歸分析法，回歸系數(shù)用bi表示，一次、二次、三次回歸分析方程分別為Y＝b0＋b1X、Y＝b0＋b1X＋b2X2、Y＝b0＋b1X＋b2X2＋b3X3，其中b2和b3為非線性系數(shù)斜率，計(jì)算bi的標(biāo)準(zhǔn)差SEi，然后行t檢驗(yàn)判斷b2和b3與0之間差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則預(yù)期值與實(shí)測(cè)值關(guān)系為線性。

2 結(jié)果

2．1 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

與羅氏NSE校準(zhǔn)品相比，準(zhǔn)確度驗(yàn)證的2份校準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果的偏倚分別是2．02%和3．72%，都在±20%范圍內(nèi)，符合相關(guān)文件的要求。見(jiàn)表1。

2．2 精密度驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)果顯示，2份質(zhì)控品批內(nèi)CV分別為0．81%和0．91%，批間CV分別為2．4%和2．3%，均符合羅氏公司的NSE項(xiàng)目說(shuō)明書(shū)參數(shù)（≤10%）。見(jiàn)表2。

2．3 AMR驗(yàn)證結(jié)果

經(jīng)多項(xiàng)式回歸分析得到b2＝5．4×10－6，b3＝4．4×10－7，經(jīng)t檢驗(yàn)與0比較，P均＞0．05，說(shuō)明二者與0差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以預(yù)期值與實(shí)測(cè)值間為線性關(guān)系，線性方程為Y＝0．204＋1．001 2X（F＝145 724，P＜0．001）；截距b0與0比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0．733，P＞0．05）；斜率b1與0比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝381．7，P＜0．001），說(shuō)明預(yù)期值與實(shí)測(cè)值間有真實(shí)的線性關(guān)系。故本次實(shí)驗(yàn)的線性范圍在1．01～351．00 ng／mL之間。見(jiàn)表3。

2．4 分析靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)果顯示，沒(méi)有超過(guò)LoB值（＜0．05 ng／mL）的數(shù)值，說(shuō)明廠商提供的參數(shù)（＜0．05 ng／mL）可用。

2．5 生物參考范圍驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)果顯示，有2例檢測(cè)結(jié)果超過(guò)范圍（分別為18．52 ng／mL和20．21 ng／mL），其余結(jié)果均為0～16．7 ng／mL，在廠商提供的參考范圍之內(nèi)，說(shuō)明該NSE參考范圍可以接受。

3 討論

NSE是一種參與糖酵解途徑的烯醇化酶，在神經(jīng)組織和神經(jīng)內(nèi)分泌組織細(xì)胞以及其所引發(fā)的腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)。NSE可作為監(jiān)測(cè)小細(xì)胞肺癌的首選標(biāo)志物，與臨床疾病進(jìn)展有良好的相關(guān)性。神經(jīng)母細(xì)胞瘤和精原細(xì)胞瘤中NSE濃度明顯增加［6］。

準(zhǔn)確度通常由對(duì)定值的質(zhì)控品或校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算偏倚，或與參考檢測(cè)系統(tǒng)以及其他標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行方法比對(duì)和偏倚評(píng)估來(lái)確定。本文先對(duì)E601發(fā)光儀進(jìn)行校準(zhǔn)；再檢測(cè)校準(zhǔn)品，將檢測(cè)結(jié)果與靶值進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算二者間相對(duì)偏倚，結(jié)果顯示2份校準(zhǔn)品與靶值的偏倚均在美國(guó)《臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)法規(guī)修正案》（CLIA’88）允許誤差范圍內(nèi)。精密度是進(jìn)行方法學(xué)性能驗(yàn)證的前提，是一個(gè)反映檢測(cè)系統(tǒng)整體性能的指標(biāo)，是指檢測(cè)系統(tǒng)在特定條件下，多個(gè)獨(dú)立的測(cè)試結(jié)果間的一致程度。本研究參考CLSIEP5-A文件以2個(gè)濃度水平羅氏質(zhì)控品為實(shí)驗(yàn)樣本，最后得到批內(nèi)和批間變異系數(shù)，方法簡(jiǎn)便易行，適合于普通臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

AMR是指患者樣本未經(jīng)稀釋和濃縮等任何預(yù)處理，由檢測(cè)方法獲得的測(cè)定值范圍［7］。經(jīng)過(guò)本次驗(yàn)證，E601分析系統(tǒng)在我室測(cè)定NSE的AMR與廠商說(shuō)明書(shū)提供的相近；分析靈敏度驗(yàn)證結(jié)果也和廠商提供數(shù)據(jù)一致；40份健康體檢者樣本血清中NSE濃度除2例偏高外，均在儀器說(shuō)明書(shū)的參考范圍之內(nèi)，按照CLSIC28-A文件的要求，可以直接使用廠商提供的參考范圍。

目前國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有ECLIA法檢測(cè)NSE方法學(xué)性能驗(yàn)證方面的報(bào)道，所以本研究對(duì)Cobas E601檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定血清NSE的一些方法學(xué)性能進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與廠商提供的性能指標(biāo)基本一致，為臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用該項(xiàng)目提供了準(zhǔn)確和可靠的依據(jù)，對(duì)于規(guī)范定量免疫檢驗(yàn)，提高檢驗(yàn)質(zhì)量有著重要意義。因?qū)嶒?yàn)成本和其他客觀因素，本研究尚有許多缺陷，如驗(yàn)證生物參考范圍用的樣本例數(shù)較少，目前江蘇省NSE尚不是室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目而無(wú)法將其用于準(zhǔn)確度驗(yàn)證中，我們將在下一步實(shí)驗(yàn)中加以完善。

［1］ CLSI．EP09-A2-IR．Method comparison and bias estimation using patient sample；approved guideline-second edition［S］．PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2002．

［2］ NCCLS．EP15-A．User demonstration of performance for precision and accuracy；approved guideline［S］．Pennsylvania：USA，2001．

［3］ NCCLS．EP6-A．Evaluation of the linearity of quantitativemeasurement procedures：a statistical approach；approved guideline［S］．Pennsylvania：USA，2003．

［4］ NCCLS．EP17-A．Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation；approved guideline［S］．Pennsylvania：USA，2004．

［5］ NCCLS．C28-A2．How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory：second edition［S］．Pennsylvania：USA，2000．

［6］ Za??ska M，Szturmowicz M，Zych J，etal．Elevated serum NSE level in locally advanced and metastatic NSCLC predispose to better response to chemotherapy but worse survival［J］．Pneumonol Alergol Pol，2010，78（1）：14－20．

［7］ 許斌．醫(yī)院檢驗(yàn)科建設(shè)管理規(guī)范［M］．2版．南京：東南大學(xué)出版社，2013：235．

R446．69

B

1671－7783（2014）05－0455－03

10．13312／j．issn．1671-7783．y140175

2014－06－22 ［編輯］ 劉星星