王亞平，焦振彬，裴宋雨，葉永忠，王紅衛(wèi)

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州450002)

播娘蒿 (Descuminia sophia(L.)Webb.ex Prantl)為十字花科播娘蒿屬1年生或2年生植物，俗名米米蒿，分布于北美洲、亞洲、歐洲及南美洲，在中國(guó)主要分布于華北、華東、西北和四川.其種子具有止咳平喘、消腫利尿、抗癌的功效［1］，在調(diào)血脂、抗菌等方面也具有顯著的藥理活性［2］.以播娘蒿種子為原料榨出的油可以作為食用油，含有約37%的α-亞麻酸，對(duì)人體的健康有重要作用［3］;亦可作為工業(yè)用油，以播娘蒿籽油為原料制備出的脂肪酸甲酯，經(jīng)冷凍處理后表現(xiàn)出和生物柴油相近的性質(zhì)［4］.播娘蒿種子含油 33% ～44%［5］，無(wú)論是作為工業(yè)用油還是食用油，都具有較大的開發(fā)利用價(jià)值.因此系統(tǒng)開發(fā)和利用播娘蒿資源，能夠很好的平衡人類對(duì)油料的需求.近年來(lái)，對(duì)播娘蒿的研究多集中在化學(xué)成分與生物學(xué)特性的分析上［6～9］，關(guān)于播娘蒿遺傳資源的研究鮮有報(bào)道.研究播娘蒿的遺傳多樣性，對(duì)今后播娘蒿野生資源的開發(fā)和利用十分必要.分子標(biāo)記是研究植物資源的有效手段，其中SSR標(biāo)記具有共顯性、重復(fù)性強(qiáng)、多態(tài)性高、多態(tài)位點(diǎn)豐富等優(yōu)點(diǎn)［10］，它比其它分子標(biāo)記如RFLP，RAPD，AFLP和ISSR雖然成本高，但能較好的運(yùn)用于植物分類、群體遺傳多樣性研究和基因圖譜的構(gòu)建.傳統(tǒng)的SSR文庫(kù)構(gòu)建策略不僅復(fù)雜，而且效率低，利用磁珠富集法構(gòu)建SSR文庫(kù)具有操作簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn).它的原理是用含有生物素標(biāo)記的探針如(CA)10與基因組DNA酶切片段含SSR片段特異性雜交，而磁珠外邊所包被的鏈霉素親和素可以和探針上的生物素共價(jià)結(jié)合，通過(guò)磁珠的磁力直接將探針連同與之互補(bǔ)的含有SSR片段吸附［11］.這種方法能顯著縮短構(gòu)建SSR文庫(kù)的時(shí)間，并且極大的提高了效率.本研究即是利用Dynal磁珠富集法構(gòu)建播娘蒿SSR文庫(kù)，研究播娘蒿的遺傳資源，為播娘蒿的資源研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

播娘蒿材料是2012-04-18采自鄭州北郊的黃河濕地國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，沿直線每隔50 m取樣1次(共20份)，采集的葉片加硅膠密封包裝，干燥處理1周后用于提取DNA.干燥處理過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)硅膠變紅，立即更換硅膠.

1.2 方法

1.2.1 酶切 本研究采用Dynal磁珠富集法構(gòu)建播娘蒿SSR文庫(kù).首先采用改良的CTAB法［12］提取播娘蒿基因組DNA，純化后利用內(nèi)切酶Rsa I于16℃溫度下酶切16 h.

1.2.2 連接 獲得的酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)后加上接頭SuperSNX 24-F(5’-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC)和 SuperSNX24-R(5’-pGATTCTGCAGCTAGGCCTTAAAC AAAA).對(duì)加接頭產(chǎn)物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL，為10×PCR 緩沖液 2.5 μL，10 μmol·L-1SuperSNX24-F 1.3 μL，2 mmol·L-1dNTP 1.875 μL，雙蒸水 18.3 μL，5 U·μL-1exTaq 0.2 μL，加接頭的 DNA 2 μL.PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min，隨后為95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸90 s的24次循環(huán)，最后15℃保持10 min.PCR反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè)，檢測(cè)成功后進(jìn)行富集工作.

1.2.3 富集 利用含有生物素標(biāo)記的(AC)8，(AG)8和(ATG)12(由上海生工合成)探針與連接產(chǎn)物充分雜交，雜交后利用Dynal磁珠對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行富集.采用PCR對(duì)富集DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 25 μL，10 × PCR 緩沖液 2.5 μL，1 000 mg·μL BSA 0.625 μL，10 μmol·L-1SuperSNX24-F 1.3 μL，2 mmol·L-1dNTP 1.875 μL，雙蒸水 16.5 μL，5 U·μL-1exTaq 0.2 μL，富集 DNA 片段 2 μL.PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min，隨后為95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸90 s的24次循環(huán)，72℃充分延伸30 min后于15℃保持10 min.PCR反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測(cè).

1.2.4 克隆及克隆篩選 將富集產(chǎn)物連接到pMD18-T上，轉(zhuǎn)入DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行克隆培養(yǎng)，挑選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng).利用SuperSNX 24-F引物對(duì)菌液克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系10 μL，包括2×PCR Taq Mix 5 μL，雙蒸水 4 μL，10 μmol·L-1SuperSNX24-F 0.5 μL，菌液 0.5 μL.反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性10 min，隨后進(jìn)入30次循環(huán)，包括94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后終延伸10 min，15℃保持10 min.選擇插入片段長(zhǎng)度為400～1 000 bp的克隆.

隨后，采用 M13F，M13R 和(AC)8，(AG)8，(ATG)5探針相結(jié)合的方法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增篩選，PCR 體系10.5 μL，包括2 ×PCR Taq Mix 5 μL ，雙蒸水 3 μL，10 μmol·L-1M13R(F)0.5 μL，10 μmol·L-1(AC)80.5μL，10 μmol·L-1(AG)80.5 μL，10 μmol·L-1(ATG)50.5 μL.反應(yīng)程序?yàn)?4℃充分變性10 min，隨后進(jìn)入30次循環(huán)，包括94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后終延伸10 min，15℃保持10 min.對(duì)擴(kuò)增出條帶的克隆送樣測(cè)序(此工作由華大基因完成).

1.3 數(shù)據(jù)處理

WEBER將SSR分為3種類型［13］，完全型為核心序列以不間斷的重復(fù)方式構(gòu)成SSR;不完全型是核心序列之間有幾個(gè)非重復(fù)堿基，但其兩端的核心序列重復(fù)次數(shù)大于3;混合型為2種或2種以上的串聯(lián)核心序列由幾個(gè)連續(xù)的非重復(fù)堿基分隔開，但各種連續(xù)性的核心序列重復(fù)次數(shù)不少于5.測(cè)序后，統(tǒng)計(jì)SSR情況，柳屬植物研究中，表現(xiàn)出多態(tài)性的二核苷酸基元重復(fù)次數(shù)在4次以上［14］，本研究統(tǒng)計(jì)二核苷酸基元重復(fù)次數(shù)在4次以上的;三核苷酸及其以上基元統(tǒng)計(jì)重復(fù)次數(shù)在3次以上［15］，計(jì)算完全型SSR，不完全型SSR以及混合型SSR各自所占的比例，以及平均單個(gè)克隆含有的SSR位點(diǎn)數(shù)等.

2 結(jié)果與分析

2.1 酶切結(jié)果

對(duì)純化后的播娘蒿總基因組DNA利用內(nèi)切酶Rsa I進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物集中在300～1 000 bp(圖1)，符合后續(xù)試驗(yàn)對(duì)DNA片段長(zhǎng)度的要求.

圖1 播娘蒿基因組DNA Rsa I酶切產(chǎn)物Fig.1 The result of enzyme digestion of Descuminia sophia genomic DNA with RsaⅠ

2.2 連接結(jié)果

以SuperSNX24-F作為引物對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2).連接結(jié)果很成功，可以直接用于下一步富集.

2.3 富集

生物素標(biāo)記的探針與加接頭的DNA片段雜交，磁珠吸附后對(duì)富集片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，為增加富集產(chǎn)物濃度，做3管PCR，富集結(jié)果如圖3，富集片段集中于500～800 bp，適用于構(gòu)建SSR文庫(kù).

圖2 連接產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR products of ligated DNA

圖3 富集產(chǎn)物PCR結(jié)果Fig.3 PCR products of microsatellite-enriched DNA

2.4 克隆篩選

將3管PCR合并純化，與PMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共挑選774個(gè)陽(yáng)性克隆至液體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4.為避免盲目測(cè)序，對(duì)有條帶的菌液用 M13R(F)通用引物和(AC)8，(AG)8，(ATG)5探針相結(jié)合進(jìn)行 2 次篩選，選取含有理想條帶的克隆進(jìn)行測(cè)序.

2.5 播娘蒿SSR統(tǒng)計(jì)

篩選獲得93條插入片段為400～1 000 bp的克隆測(cè)序.經(jīng)測(cè)序，82條序列含有SSR位點(diǎn)，占測(cè)序總條數(shù)的88.17%.共有SSR位點(diǎn)數(shù)127個(gè)，完全型SSR位點(diǎn)數(shù)目102個(gè)，不完全型SSR位點(diǎn)數(shù)目10個(gè)，混合型SSR位點(diǎn)15個(gè).SSR重復(fù)單元(表1)中，以二核苷酸(TC/CT)，(AC/CA)，(TG/GT)和三核苷酸(TGA/GAT/ATG)最為常見，得率分別為 20.47%，26.77%，21.26%和 15.75%.

圖4 菌液PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR amplification of clones

表1 播娘蒿微衛(wèi)星富集文庫(kù)基元類型及比例Table 1 Characteristics of the enriched library of Descuminia sophia in terms of the identified microsatellite sequences

本研究采用磁珠富集法構(gòu)建播娘蒿SSR文庫(kù)，該方法中探針與不含SSR位點(diǎn)的片段存在一定程度的結(jié)合，為減少測(cè)序的盲目性，使用M13R載體通用引物和(AC)8，(AG)8，(ATG)5探針相結(jié)合進(jìn)行2次篩選，共測(cè)序93條，含有SSR位點(diǎn)的序列就有82條，占測(cè)序總條數(shù)的88.17%.

播娘蒿SSR文庫(kù)中出現(xiàn)了16種重復(fù)基元，以二核苷酸 AC/CA，TG/GT，TC/CT和三核苷酸TGA/GAT/ATG出現(xiàn)次數(shù)最多，分別為34，27，26和20次，占 SSR位點(diǎn)總數(shù)的20.47%，26.77%，21.26%和15.75%，其它重復(fù)基元出現(xiàn)次數(shù)較少.本研究使用的生物素探針為(AC)8，(AG)8和(ATG)12，研究結(jié)果中SSR基元多以與這些探針互補(bǔ)配對(duì)為主.如果增加更多類型的探針，估計(jì)會(huì)得到更多類型的SSR基元.文庫(kù)中，二核苷酸基元最多重復(fù)35次，三核苷酸單元最多重復(fù)26次，四核苷酸基元最多重復(fù)4次，六核苷酸基元最多重復(fù)4次.

播娘蒿SSR位點(diǎn)中，重復(fù)次數(shù)在4～35次(表2)，重復(fù)次數(shù)在4～10次的有80個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的62.99%;重復(fù)次數(shù)在11～20次的有31個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的24.41%;重復(fù)次數(shù)在20次以上的有16個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的12.60%.

表2 SSR重復(fù)次數(shù)分布Table 2 SSR repetition number distribution

播娘蒿SSR位點(diǎn)中，重復(fù)長(zhǎng)度在8～95 bp(表3)，重復(fù)長(zhǎng)度在8～20 bp的有65個(gè)，占SSR位點(diǎn)數(shù)的51.18%;重復(fù)長(zhǎng)度在20～40 bp的有40個(gè)，占SSR位點(diǎn)數(shù)的31.50%;重復(fù)長(zhǎng)度大于40 bp的有22個(gè)，占SSR位點(diǎn)數(shù)的17.32%.

表3 SSR重復(fù)長(zhǎng)度分布Table 3 SSR repeatitiion length distribution

3 討論

播娘蒿SSR重復(fù)基元以二核苷酸重復(fù)基元最多，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的69%.在蓮屬植物的研究中，設(shè)計(jì)的11對(duì)SSR引物全部來(lái)自于二核苷酸重復(fù)的基因序列［16］;谷子的研究中，分析多態(tài)性的22對(duì)引物中有20對(duì)引物的SSR為二核苷酸重復(fù)［17］;用于分析銀杏遺傳多樣性的11對(duì)引物其SSR全部為二核苷酸重復(fù)［18］.這說(shuō)明用二核苷酸重復(fù)基元的DNA片段設(shè)計(jì)引物，較容易檢測(cè)多態(tài)性.本研究獲得的播娘蒿SSR文庫(kù)中，二核苷酸重復(fù)的位點(diǎn)占69.68%，滿足開發(fā)SSR標(biāo)記的需要.

杜仲20個(gè)能檢測(cè)到多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記中，其二核苷酸SSR重復(fù)次數(shù)在9～16次，三核苷酸SSR重復(fù)次數(shù)在7～12次［19］;蘭屬植物遺傳多樣性研究中，表現(xiàn)出多態(tài)性的14對(duì)SSR引物中，二核苷酸SSR重復(fù)次數(shù)在9～32次，三核苷酸SSR重復(fù)次數(shù)在4～12次［20］;中國(guó)紅棗的研究中，表現(xiàn)出多態(tài)性的25對(duì)SSR引物，全部為二核苷酸基元重復(fù)，重復(fù)次數(shù)在6～15次［21］.而播娘蒿的二核苷酸基元重復(fù)次數(shù)分布在4～35之間，三核苷酸基元重復(fù)次數(shù)分布在4～26，大部分克隆含有潛在多態(tài)SSR位點(diǎn)，可進(jìn)行下一步開發(fā) SSR位點(diǎn)引物的工作.

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