李翰書，盧妍妍，李海英，2，茹廣欣，楊 陽，候 婷，楊永紅

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南鄭州450002;2.華北水利水電學(xué)院，河南鄭州450002)

泡桐屬(Paulownia)屬于玄參科(Scrophulariaceae)落葉喬木，原產(chǎn)于中國，在全國23個(gè)省、市、自治區(qū)均有分布，是重要的速生優(yōu)質(zhì)用材樹種和綠化樹種.由于泡桐材質(zhì)輕軟，不翹裂，脹縮性小，是優(yōu)質(zhì)的家具用材和裝飾用材［1］.另外，由于泡桐的葉、花、果、樹皮還具有良好的藥用價(jià)值，因此，泡桐占有重要的國民經(jīng)濟(jì)地位.關(guān)于泡桐屬植物的栽培、育種以及依據(jù)外部形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行的種間親緣關(guān)系探討已做了比較深入研究［2］，但由于表型性狀經(jīng)常會(huì)受環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化，有些情況下表型變化并不能真實(shí)反映遺傳變異，要更加準(zhǔn)確、細(xì)致地理解種群的遺傳變異狀況，僅僅依賴表型性狀是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還必須進(jìn)行更深層次的研究，并加以比較和驗(yàn)證［3］.目前對(duì)泡桐在分子水平上的分類只有盧龍斗等［4］運(yùn)用RAPD分析方法將泡桐屬7種植物分為白花泡桐、川泡桐、楸葉泡桐、南方泡桐、山明泡桐組和毛泡桐、蘭考泡桐組2大類群;馬浩等［5］利用RFLP分子標(biāo)記法對(duì)泡桐屬15個(gè)植物的葉綠體DNA進(jìn)行分析，最終將研究材料分為南方泡桐組、毛泡桐組和白花泡桐組;莫文娟等［6］則運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)泡桐屬21份種、變種及變型材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析，最終將供試材料分為3大類群，分別是臺(tái)灣泡桐和川泡桐;白花泡桐、南方泡桐2、南方泡桐1、南方泡桐3、鄂川泡桐、建始泡桐和成都泡桐;蘭考泡桐1、蘭考泡桐2、山明泡桐2、山明泡桐1、白花蘭考泡桐、楸葉泡桐2、楸葉泡桐l、圓冠泡桐、宜昌泡桐、亮葉毛泡桐、毛泡桐l和毛泡桐2.上述所得結(jié)論存在一定差異，種群之間的分類仍存在較多爭議.擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism AFLP)，結(jié)合了RFLP和RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，擴(kuò)增條帶豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好是目前綜合效應(yīng)較高的分子標(biāo)記方法.目前廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源研究［7～11］、系統(tǒng)分類［12，13］、遺傳多樣性檢測［14～16］以及遺傳圖譜的構(gòu)建和基因定位等方面，已成為材料間遺傳多樣性和分類研究的有效手段［17］.但有關(guān)AFLP技術(shù)在泡桐上的應(yīng)用還未見報(bào)道，本研究旨在利用FISHAFLP分子標(biāo)記技術(shù)，研究探討泡桐屬植物種間的親緣關(guān)系，為該屬植物的系統(tǒng)分類和遺傳育種提供更可靠的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用材料(表1)采自江西九江共青城泡桐種源育種基地，每份材料選取3～5片新鮮嫩葉，置于采樣箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存?zhèn)溆?

表1 供試材料Table 1 Materials tested in the experiment

本試驗(yàn)所用試劑:Taq酶(2 U·μL-1)、dNTPs(10 mmol·L-1)、引物(10 mmol·L-1)以及 B002-1 Marker，DGL 2000 Marker均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，內(nèi)切酶(10 U·μL-1)、T4連接酶(5 U·μL-1)及ROX 500相對(duì)分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)則分別購自NEB公司和ABI公司.試驗(yàn)所用接頭和擴(kuò)增引物序列詳見表2.

1.2 總DNA的制備及檢測

參照DOYLE等［18］經(jīng)典的CTAB法略加改動(dòng)提取DNA總基因組并加以純化.具體方法:稱取泡桐葉片50 mg，液氮研磨成粉狀，并將粉末轉(zhuǎn)移到裝有800 μL 2×CTAB提取液的2 mL離心管中，加入60 μL巰基乙醇混勻，60℃預(yù)熱30 min，其間混勻2～3次，取出樣品于室溫放置，待樣品冷卻到室溫加入800 μL［V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1］，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液到另一新2 mL離心管，加入等體積的氯仿與異戊醇［V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1］，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液到新的2 mL離心管中加入1.5倍體積1×CTAB沉淀液，放置20 ～30 min，12 000 r·min-1離心 15 min 將沉淀晾干溶于 200 μL TE-buffer(溶解)，加入 400 μL 95% 乙醇，20 μL 3 mmol·L-1乙酸鈉，-20 ℃ 沉淀1 h后4 ℃ ，12 000 r·min-1離心 15 min，加入500 μL 75% 乙醇洗滌，12 000 r·min-1離心10 min后加入 30 ～50 μL TE-buffer稀釋，經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后-20℃保存?zhèn)溆?，使用前將其稀釋?50 mg·L-1.

表2 擴(kuò)增引物序列及名稱Table 2 The sequences and name of the amplification primer

1.3 AFLP 分析

1.3.1 限制性酶切及連接反應(yīng) 采用北京鼎國生物技術(shù)公司的試劑盒，按照其操作指南酶切連接一步進(jìn)行.在20 μL反應(yīng)體系中含有DNA模板(50 mg·L-1)4 μL，Adapter 1 μL，PstI和 MseI 2 μL，10×Reaction buffer 2.5 μL，10 mM ATP 2.5 uL，T4 Ligase 1 μL，AFLP-Water7 μL.將上述混合液混勻離心數(shù)秒，37℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃過夜.

1.3.2 預(yù)擴(kuò)增 參照馬慶國等［17］的16個(gè)早實(shí)核桃良種遺傳多樣性AFLP分析的預(yù)擴(kuò)增體系及預(yù)擴(kuò)增程序，將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物經(jīng)1∶20稀釋后作為選擴(kuò)模板.

1.3.3 選擇性擴(kuò)增 用篩選出的9對(duì)引物組合(表2)經(jīng)熒光標(biāo)記后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增(對(duì)MseI引物的5’端進(jìn)行熒光標(biāo)記).25 μL擴(kuò)增體系中含有2 μL 預(yù)擴(kuò)稀釋樣品，2.5 μL 10 × PCR buffer，0.5 μL dNTPs，PstI和 MseI引物各 1 μL，0.5 μL Taq酶，最后用ddH2O補(bǔ)足體系.將上述體系混勻，離心數(shù)秒后參照寧德魯?shù)龋?9］的云南省核桃品種遺傳多樣性的FISH-AFLP擴(kuò)增程序進(jìn)行選擇性擴(kuò)增.

1.4 電泳與數(shù)據(jù)分析

將選擇擴(kuò)增后的樣品在ABI 377自動(dòng)測序儀上電泳分離檢測［20］，然后把14份供試材料9對(duì)熒光引物產(chǎn)生的電泳凝膠圖通過GeneScan 3.1軟件轉(zhuǎn)換為“0/1”矩陣(即根據(jù)凝膠上不同材料同一位置條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶記為“l(fā)”，無帶記為“0”).對(duì)原始矩陣用 NT-SYSpc 2.10 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過SimQual程序求相似系數(shù)，并獲得相似系數(shù)矩陣;用SHAN程序中的UPGMA進(jìn)行聚類分析，并通過Treeplot模塊生成聚類圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 泡桐屬植物葉片DNA的檢測結(jié)果

所提取的泡桐屬植物基因組DNA通過DG-III雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀在電壓180 V，電泳時(shí)間1 h條件下經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，所提取的DNA有較清晰的電泳條帶，可用于AFLP擴(kuò)增.

2.2 泡桐屬植物葉片DNA的多態(tài)性分析

從64對(duì)引物組合中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性高且分辨能力強(qiáng)的引物組合［20］，利用所選出的9對(duì)引物組合(表3)對(duì)14份供試材料進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，獲得了較好的擴(kuò)增結(jié)果(圖2).共檢測到DNA片段1 171條，大小為70～500 bp，其中多態(tài)性條帶1 158條，平均每個(gè)引物組合檢測到多態(tài)性片段128.7條，平均多態(tài)性比率高達(dá)98.9%，這表明14份泡桐品種具有較高比例的多態(tài)性條帶.其中引物組合P-GTG/M-CAG檢測到的條帶最多，171條均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為100%;引物組合P-GAG/M-CAC共獲得總條帶115條，多態(tài)性條帶 107條，多態(tài)性比例為93.04%，但在所選用的9對(duì)引物組合中多態(tài)性比例最低.可見，F(xiàn)ISH-AFLP檢測泡桐品種遺傳多樣性的效率很高，也充分體現(xiàn)了試驗(yàn)材料具有豐富的遺傳多樣性.

圖1 泡桐屬植物基因組DNA電泳Fig.1 Gel electrophoretogram of the genus Paulownia genomic DNA

2.3 泡桐屬種間聚類與遺傳關(guān)系分析

利用NT-SYSpc 2.10軟件計(jì)算泡桐屬植物種間遺傳相似系數(shù)并基于UPGMA法繪制泡桐屬種質(zhì)間親緣關(guān)系樹狀圖(圖3).由圖3可知，當(dāng)閾值為0.675時(shí)，可將14份供試材料分成Ⅳ個(gè)類群.其中，類群Ⅰ包括白花泡桐、臺(tái)灣泡桐、南方泡桐、山明泡桐、宜昌泡桐、鄂川泡桐、蘭考泡桐、建始泡桐以及白花蘭考泡桐;類群Ⅱ包括毛泡桐、亮葉毛泡桐以及川泡桐;類群Ⅲ和Ⅳ均由1個(gè)泡桐種群組成，分別為楸葉泡桐和成都泡桐.

表3 不同引物組合在泡桐種群中的多態(tài)位點(diǎn)比率Table 3 The polymorphic ratio of different primers combination in Paulownia species

圖2 引物組合P-GAT/M-CAG對(duì)14個(gè)泡桐屬植物的AFLP擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of primer combination P-GAT/M-CAG to 14 genus Paulownia plants

3 結(jié)論與討論

圖3 14份泡桐屬植物的聚類分析圖Fig.3 Clustering analysis diagram of the 14 genus Paulownia plants

盧龍斗等［4］對(duì)泡桐屬7種植物的RAPD分析中，選用13個(gè)引物共擴(kuò)增出89條譜帶，其中多態(tài)性譜帶有63條，多態(tài)性比率為70.79%;莫文娟等［6］運(yùn)用9條ISSR引物對(duì)泡桐屬植物進(jìn)行親緣關(guān)系分析，共擴(kuò)增出85條片段，多態(tài)性條帶74條，多態(tài)性比率為87.05% .本試驗(yàn)采用 FISH-AFLP技術(shù)，運(yùn)用9對(duì)引物組合對(duì)14份泡桐屬植物進(jìn)行了基因組DNA分子水平上的檢測，共獲得多態(tài)性條帶1 158條，多態(tài)性百分率達(dá)98.89% ，表現(xiàn)出更高的檢測效率，說明FISH-AFLP方法得到的信息量較大，是一種較好的用于分析遺傳多態(tài)性和指紋圖譜分析的標(biāo)記方法［19］.陳志遠(yuǎn)等［21］認(rèn)為南方泡桐(Paulownia australis)和臺(tái)灣泡桐(Paulownia kawakamii)應(yīng)合為1種并將南方泡桐作為異名，本研究在DNA水平上提供了一定的理論基礎(chǔ)，顯示南方泡桐和臺(tái)灣泡桐親緣關(guān)系最近，被聚在1個(gè)亞群.同時(shí)，鄂川泡桐與蘭考泡桐聚為1個(gè)亞群，這與陳志遠(yuǎn)等［21］鄂川泡桐應(yīng)為南方泡桐與蘭考泡桐的雜交種的觀點(diǎn)一致.白花蘭考泡桐是根據(jù)花冠顏色而定的［22］，本試驗(yàn)結(jié)果也得出白花蘭考泡桐與蘭考泡桐聚為1組的結(jié)論，它們間的遺傳相似系數(shù)比較大，也說明它們的親緣關(guān)系較近.本研究同樣在DNA水平上支持白花蘭考泡桐為蘭考泡桐的變型這一觀點(diǎn).陳志遠(yuǎn)等［21，23］的泡桐屬植物同工酶分析及泡桐屬的地理分布中均認(rèn)為山明泡桐的譜帶一部分與蘭考泡桐相同，一部分與毛泡桐相同，因此得出結(jié)論，山明泡桐可能是蘭考泡桐和毛泡桐的雜交種.本研究結(jié)果顯示，山明泡桐與蘭考泡桐被聚在1個(gè)亞群，支持了這一觀點(diǎn).1995年熊金橋等［2］用數(shù)量分類的方法對(duì)泡桐屬植物的38個(gè)性狀進(jìn)行分析，并對(duì)所分析的種或變種進(jìn)行了系統(tǒng)聚類，最終把該屬植物分成3個(gè)組，即白花泡桐組:白花泡桐、蘭考泡桐等;毛泡桐組:毛泡桐、川泡桐、南方泡桐等;楸葉泡桐組:楸葉泡桐、山明泡桐等.在本研究結(jié)果中，雖然山明泡桐沒有歸入楸葉泡桐組中，但從遺傳相似系數(shù)可以看出二者的遺傳一致度也比較大，這與熊金橋等［2］的研究結(jié)果基本相符.但在本研究中，成都泡桐和楸葉泡桐被單獨(dú)聚為1組，且成都泡桐被聚在了最外類群，得出了與以往結(jié)果不一致的結(jié)論，還需要更進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證.

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