梁相志，李靜靜，盧少華，潘建斌，吳莉莉，邢玉清，閆鳳鳴

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河南 鄭州450002)

刺吸電位技術(shù)(Electrical Penetration Graph，EPG)是用來記錄刺吸式口器昆蟲(如棉蚜、煙粉虱、棉盲蝽、稻褐飛虱等)口針在寄主組織中刺探、取食行為電信號變化特征的技術(shù)，可以準(zhǔn)確記錄刺吸式口器昆蟲口針在寄主組織中的刺探行為和位置，使昆蟲口針在植物內(nèi)的活動轉(zhuǎn)化為一種可視信號［1］，目前主要應(yīng)用于刺吸式口器昆蟲的取食行為、傳播植物病毒和植物抗蟲機(jī)制等方面的研究［2～4］.MCLEAN 等［5］最早研制的取食監(jiān)測系統(tǒng)(Electronic Measurement System，EMS)，其輸入電阻(Ri)為106Ω，只能初步證明蚜蟲不同取食行為產(chǎn)生的輸出波形不同.這一技術(shù)在實(shí)踐中得到了多次改進(jìn)［1，6～8］，TJALLINGII［1］采用直流回路系統(tǒng)，并使用高值輸入電阻(Ri)109Ω，使儀器能輸出更加準(zhǔn)確、細(xì)致的波譜.目前有直流和交流2種EPG系統(tǒng)，基于交流電路設(shè)計(jì)的系統(tǒng)稱為交流刺吸電位儀(Alternating Current EPG，AC-EPG)，其 R成分和emf成分的變換都可引起輸出電壓的變化;基于直流電路設(shè)計(jì)的系統(tǒng)稱為直流刺吸電位儀(Direct Current EPG，DC-EPG)，其R成分固定，輸出電壓的變化僅為emf成分，中國目前應(yīng)用的基本都是DC-EPG.EPG技術(shù)可作為研究刺吸式昆蟲取食行為的最為有效的工具，是因?yàn)镋PG的波譜與昆蟲的刺探行為、唾液分泌、取食等生理過程相對應(yīng)，可以通過對EPG波譜的分析認(rèn)識昆蟲的取食過程.MCLEAN等［9］分析了豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)取食行為與電子記錄波形的對應(yīng)關(guān)系.該技術(shù)在植食性刺吸式昆蟲(如蚜蟲、粉虱、葉蟬和薊馬等)與植物關(guān)系研究中的應(yīng)用日益深入，尤其是對蚜蟲和粉虱的研究.介體昆蟲中主要以半翅目昆蟲為主，這些昆蟲(如棉蚜、煙粉虱、棉盲蝽、稻褐飛虱等)多數(shù)為農(nóng)林作物害蟲，依靠其取食口器在植物上頻繁地進(jìn)行刺探取食活動，成為傳播植物病毒效率最高的介體，這是因?yàn)榘氤崮坷ハx口針刺探寄主植物對植物細(xì)胞造成的損害較小，因此更適于傳播病毒［10］.最近的研究表明介體傳播病毒與其取食行為有關(guān)，EPG技術(shù)已經(jīng)成為研究介體傳毒機(jī)理地有效工具［2，4，11，12］.目前，多數(shù)的 EPG 研究已不再局限于分析不同種昆蟲的刺探、取食行為波形差異，而是建立在波形基礎(chǔ)上的刺吸式口器昆蟲對寄主植物的選擇性、昆蟲傳播植物病毒的機(jī)制和植物的抗蟲機(jī)制以及內(nèi)吸性農(nóng)藥的測定等行為生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，并已成為昆蟲生理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一.為了深入研究介體取食行為與傳毒之間的關(guān)系、植物的抗蟲機(jī)制及內(nèi)吸性農(nóng)藥的測定，需要更為精細(xì)的波形，因此，本研究基于提高EPG儀器的輸入電阻(Ri)對刺吸電位儀進(jìn)行改進(jìn)，以獲得更為精確的波形.

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx和植物

煙蚜Myzus persicae為實(shí)驗(yàn)室在煙草Nicotiana tabacum(中煙100)植株上飼養(yǎng)的多代種群，飼養(yǎng)條件為溫度(28±2)℃，光周期16 L∶8 D，相對濕度(75±2)%.煙草(中煙100)在溫室內(nèi)同樣條件下培養(yǎng).無翅成蚜和4～5葉期煙苗用于EPG記錄.

1.2 EPG儀器改進(jìn)方案

現(xiàn)有荷蘭產(chǎn)直流刺吸電位儀Giga-4型輸入電阻為109Ω，對原有運(yùn)算放大器已達(dá)設(shè)計(jì)極限，為此，通過對運(yùn)算放大器和信號放大通道進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得輸入電阻可以提高到1010Ω，明顯提高波形的相對振幅和頻率［8］，將輸入電阻提高到1010Ω，這在國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見報道.

增加輸入電阻(Ri)是獲得精細(xì)波形的有效途徑.現(xiàn)有EPG儀中輸入阻抗最高可達(dá)109Ω，改進(jìn)的儀器輸入電阻采用1010Ω.研究表明，輸入阻抗越高，儀器輸出的生物電信號響應(yīng)會越明顯［8］.用增加輸入電阻(1010Ω)的直流刺吸電位儀Giga-4型(DC-EPG)進(jìn)行蚜蟲在煙草植株上的取食行為記錄試驗(yàn)，數(shù)字轉(zhuǎn)換器(A/D)為 DI-720型(DATAQ instruments).以現(xiàn)有 EPG(輸入電阻為109Ω)記錄蚜蟲在煙草植株上的取食行為作為對照.

1.3 波形記錄

試驗(yàn)所用金絲(直徑12.5 μm)購自荷蘭瓦赫寧根大學(xué)，導(dǎo)電銀膠為本實(shí)驗(yàn)室(河南農(nóng)業(yè)大學(xué))配制(專利授權(quán)號ZL201010610889).按照湯清波等［13］的方法將2～3 cm的金絲用導(dǎo)電銀膠粘連到蚜蟲的前胸背板上.在粘連金絲之后，對蚜蟲進(jìn)行30 min饑餓處理，隨后將蚜蟲放在煙草上，連續(xù)記錄蚜蟲取食行為6 h.波形由A/D轉(zhuǎn)換器收集并轉(zhuǎn)換，在計(jì)算機(jī)上由 WinDaq軟件(DATAQ instruments)顯示波形.

對所記錄波形進(jìn)行分析，記錄波形的振幅、頻率、電壓水平.蚜蟲的pd波、E1波和E2波特征比較明顯，pd波表明蚜蟲口針在植物細(xì)胞內(nèi)刺探，E1波表明蚜蟲在植物韌皮部內(nèi)分泌唾液和主動取食，E2波表明蚜蟲在植物韌皮部內(nèi)被動取食，因此對EPG輸入電阻為109Ω和1010Ω時記錄的蚜蟲pd波、E1波和E2波特征(相對振幅、頻率和電壓水平等)進(jìn)行比較.相對振幅是以整個波形最高電壓振幅為100的前提下進(jìn)行比較，頻率為每秒波動的次數(shù)，電壓水平由WinDaq軟件顯示記錄.

2 結(jié)果與分析

2.1 整體記錄波形對比

增加輸入電阻為1010Ω，記錄蚜蟲在煙草上的取食波形與原EPG儀器記錄波形進(jìn)行比較，從圖1(A，B)可以看到，輸入電阻為1010Ω時所記錄的波形與原儀器記錄的波形相似，整體上變化不大.未刺探波與基線幾乎重疊，波動頻率非常小.A圖和B圖中波形的刺探波頻率類似，為正壓;A圖和B圖中蚜蟲在煙草植株上的韌皮部取食波形變化相似，均為負(fù)壓.

2.2 pd 波比較

增加輸入電阻后記錄的pd波相對振幅和頻率均有所提高.增加輸入電阻后記錄的pd波相對振幅為65.55，較現(xiàn)在刺吸電位儀記錄的pd波的相對振幅(63.42)高，頻率也有所增加(表1).蚜蟲的pd波又可分為pd-I，pd-II和pd-III 3部分，其中pd-II亞波為負(fù)壓波形部分，又可細(xì)分為II-1，II-2和II-3部分.圖1中C圖pd亞波和D圖pd亞波相比，相對振幅和頻率有所提高，II-1和II-3部分尤為明顯(表1).

圖1 不同輸入電阻下DC-EPG記錄波形比較Fig.1 Comparison of DC-EGP waveforms under different input resistors

表1 DC-EPG波形特征比較Table 1 Characters of DC-EPG waveforms

2.3 E1 波比較

增加輸入電阻后，EPG記錄的蚜蟲在韌皮部取食的波形比較均一，相對振幅和頻率有所提高.從圖1(E，F(xiàn))可以觀察到，增加輸入電阻1個數(shù)量級后，E1波的波動比較均一，相對振幅為13.42，頻率為3.88 Hz;F圖為原刺吸電位儀記錄的E1波形，波動落差較大，相對振幅為12.72，頻率為2.75 Hz.增加輸入電阻后記錄的E1波較原儀器記錄的E1波在頻率上差異顯著(P＜0.05).

2.4 E2 波比較

E2波為昆蟲在韌皮部內(nèi)被動取食的波形，增大輸入電阻后所記錄的波形較為均一，相對振幅和頻率有所提高.從圖1(G，H)可以觀察到，增加輸入電阻后記錄的E2波變化較為均一，相對振幅和頻率均較原有儀器記錄的波形有所提高(表1).增加輸入電阻后記錄的E2波較原儀器記錄的E2波在相對振幅和頻率上差異顯著(P＜0.05).

3 討論

增加EPG儀器的輸入電阻(Ri)為1010Ω，波形的相對振幅和頻率均有所提高，表明增加輸入電阻能夠有效提高波形的精確度.昆蟲介體傳播植物病毒與其取食過程中口針刺破細(xì)胞膜的行為有關(guān)［11，14，15］，利用 EPG 分析昆蟲的取食行為可以評價昆蟲的獲毒、傳毒細(xì)節(jié).由于蚜蟲傳毒時必須將病毒分泌到植物的活細(xì)胞內(nèi)病毒才能存活，同時獲毒亦需要從細(xì)胞或韌皮部吸食時進(jìn)行，因此穿刺細(xì)胞的pd波和韌皮部波形(分泌唾液的E1波和吸食汁液的E2波)對傳毒尤為重要，通過增加輸入電阻獲得精確度更高的波形，將有助于介體傳毒方面的研究.POWELL［16］使用EPG技術(shù)研究了桃蚜M.persicae傳播馬鈴薯Y病毒的取食行為，發(fā)現(xiàn)pd波的出現(xiàn)對桃蚜的成功傳毒有關(guān).pd波是昆蟲在植物表皮層細(xì)胞的試探性取食時刺破細(xì)胞膜而產(chǎn)生的，蚜蟲的pd波又可分為pd-Ⅰ，pd-Ⅱ和pd-Ⅲ3部分，其中pd-Ⅱ亞波又可細(xì)分為Ⅱ-1，Ⅱ-2和Ⅱ-3部分，pd-Ⅱ亞波與介體獲毒、接種病毒有關(guān)，蚜蟲的獲毒過程發(fā)生在pd亞波的Ⅱ-3階段(取食)，接種病毒過程發(fā)生在Ⅱ-1和Ⅱ-2階段(分泌唾液)［14，17，18］.圖 1(C，D)比較了不同輸入電阻(Ri)所記錄的pd波，尤其是pd-Ⅱ亞波，結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)增加輸入電阻1個數(shù)量級后，記錄的波形相對振幅和頻率有所提高，輸出波形更為精確，可以更好地應(yīng)用于分析介體昆蟲的取食行為與傳播植物病毒間的關(guān)系.

研究表明介體昆蟲傳播植物病毒與其取食行為有關(guān)，通過增加輸入電阻改進(jìn)EPG，可以更好地應(yīng)用于介體傳毒行為方面的研究.JIANG等［2］利用刺吸電位技術(shù)研究煙粉虱的取食行為與傳播番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)之間的關(guān)系，通過比較213頭帶毒煙粉虱在單株植物上的取食行為，發(fā)現(xiàn)煙粉虱的傳播效率與E1波出現(xiàn)的次數(shù)和E1波持續(xù)的時間有關(guān)，帶毒煙粉虱的刺探次數(shù)和E1波持續(xù)時間明顯增多.STAFFORD［12］利用EPG技術(shù)研究西花薊馬(Western flower thrips)傳播番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)，發(fā)現(xiàn)TSWV能增加西花薊馬的刺探次數(shù)來促進(jìn)病毒傳播.LIU等［4］利用EPG技術(shù)研究煙粉虱的取食行為與傳播TYLCV之間的關(guān)系，通過比較B型和Q型煙粉虱分別在介體帶毒水平和植物帶毒水平上取食行為，發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱在帶毒植物上有更多的取食行為.利用改進(jìn)后的EPG波形進(jìn)行介體傳播植物病毒與取食行為關(guān)系的研究，通過分析更為精確的波形，可能會提供更有力的證據(jù).

EPG技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于研究內(nèi)吸性殺蟲劑吡蟲啉(Imidacloprid)對刺吸式口器昆蟲(薊馬、蚜蟲、煙粉虱)取食行為的影響［19～22］，CUI 等［23］利用EPG研究了環(huán)氧蟲啶(Cycloxaprid)對吡蟲啉抗性蚜蟲(Imidacloprid-resistant aphids)的取食影響.通過增加輸入電阻1個數(shù)量級后，輸出的波形具有更高的精確度，在以后的研究中可將改進(jìn)后的EPG儀器應(yīng)用于內(nèi)吸性殺蟲劑對昆蟲取食行為影響的研究.

目前使用的刺吸電位儀存在一些不足，如對環(huán)境干擾敏感、信號獲取和分析軟件不穩(wěn)定和使用材料限制昆蟲活動等，雖然增加輸入電阻可以改善波形的精確度，但很難滿足現(xiàn)代科研的需要.因此，我們還將進(jìn)一步對刺吸電位儀進(jìn)行創(chuàng)新，采用新型硬件設(shè)計(jì)全面提高儀器的抗干擾性能，采用新型運(yùn)算放大器和新型A/D采集卡，同時應(yīng)用FFT、隨機(jī)共振和小波變換等數(shù)字信號處理方法，全面提高信噪比，使儀器輸出波形的分辨率和精確度比現(xiàn)有儀器提高10倍以上，這將有助于介體昆蟲取食行為與傳毒機(jī)理的研究.

［1］ TJALLINGJI W F.Electronic recording of penetration behaviour by aphids［J］.Entomol Exp App，1978，24(3):721-730.

［2］ JIANG Y X，DE BLAS C，BARRIOS L，et al.Correlation between whitefly(Homoptera:Aleyrodidae)feeding behavior and transmission of Tomato yellow leaf curl virus［J］.Ann Entomol Soc Am，2000，93(3):573-579.

［3］ MAUCK K E，DE MORAES C M，MESCHER M C.Deceptive chemical signals induced by a plant virus attract insect vectors to inferior hosts［J］.Proc Natl Acad Sci，2010，107(8):3600-3605.

［4］ LIU B M，PREISSER E L，CHU D，et al.Multiple forms of vector manipulation by a plant-infecting virus:Bemisia tabaci and Tomato yellow leaf curl virus［J］.J Virol，2013，87:4929-4937.

［5］ MCLEAN D L，KINSEY M G.A technique for electronically recording aphid feeding and salivation ［J］.Nature，1964，202:1358-1359.

［6］ TJALLINGII W F.Electrical nature of recorded signals during stylet penetration by aphids［J］.Entomol Exp Appl，1985，38:177-186.

［7］ PRADO E，TJALLINGII W F.Aphid activities during sieve element punctures ［J］.Entomol Exp Appl，1994，72:157-165.

［8］ BACKUS E A，BENNETT W H.The AC-DC correlation monitor:New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran ［J］.J Insect Physiol，2009，55(10):869-884.

［9］ MCLEAN D L，KINSEY M G.Probing behavior of the pea aphid，Acyrhosiphoum pisum Ⅲ.effect of temperature on certain probing activities［J］.Ann Entomol Soc Am，1968，61:927-933.

［10］ NAULT L R.Arthropod transmission of plant viruses:a new synthesis［J］.Ann Entomol Soc Am，1997，90:521-541.

［11］ POWELL G，HARRINGTON R，SPILLER N J.Stylet activities and potato virus Y vector efficiencies by the aphids Brachycaudus helichrysi and Drepanosiphum platanoidis［J］.Entomol Exp App，1992，62:293-300.

［12］ STAFFORD C A，WALKER G P，ULLMAN D E.Infection with a plant virus modifies vector feeding behavior［J］.Proc Natl Acad Sci，2011，108(23):9350-9355.

［13］ 湯清波，張大山，姬 琨，等.刺吸電位技術(shù)應(yīng)用中的幾個問題［J］.應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2011，48(5):1519-1527.

［14］ 張鵬飛，陳建群，張 閑，等.棉蚜獲得黃瓜花葉病毒的行為與取食過程的關(guān)系［J］.昆蟲學(xué)報，2011，44(4):395-401.

［15］ 苗 進(jìn)，武予清，郁振興，等.基于EPG的麥長管蚜、麥二叉蚜和禾谷縊管蚜取食行為的比較［J］.生態(tài)學(xué)報，2011，31(1):175-182.

［16］ POWELL G.Cell membrane punctures during epidermal penetrations by aphids:consequences for the transmission of two potyvirus ［J］.Annal Applied Biology，1991，119:313-321.

［17］ POWELL G，PIRONE J，HARDIE J.Aphid stylet activities during potyvirus acquisition from plants and an in vitro system that correlate with subsequent transmission［J］.Eur J Plant Pathol，1995，101:411-420.

［18］ FERNANDEZ-CALVINO L，LOPEZ-ABELLA D，LOPEZ-MOYA J J，et al.Comparison of Potato virus Y and Plum pox virus transmission by two aphid species in relation to their probing behavior［J］.Phytoparasitica，2006，34:315-324.

［19GROVES R L，SORENSON C E，WALGENBACH J F，et al.Effects of imidacloprid on transmission of Tomato spotted wilt tospovirus to pepper，tomato and tobacco by Frankliniella fusca Hinds(Thysanoptera:Thripidae)［J］.Crop Prot，2001，20:439-445.

［20］ JOOST P H，RILEY D G.Imidacloprid effects on probing and settling behavior of Frankliniella fusca and Frankliniella occidentalis(Thysanoptera:Thripidae)in tomato［J］.J Econ Entomol，2005，98:1622-1629.

［21］ HE Y X，ZHAO J W，ZHENG Y，et al.Assessment of potential sublethal effects of various insecticides on key biological traits of the tobacco whitefly，Bemisia tabaci［J］.Int J Biol Sci，2013，9(3):246-255.

［22］ FRAY L M，LEATHER S R，POWELL G，et al.Behavioural avoidance and enhanced dispersal in neonicotinoid-resistant Myzus persicae(Sulzer)［J］.Pest Manag Sci，2014，70:88-96.

［23］ CUI L，SUN L，YANG D B，et al.Effects of cycloxaprid，a novel cis-nitromethylene neonicotinoid insecticide，on the feeding behavior of Sitobion avenae［J］.Pest Manag Sci，2012，68:1481-1491.