吳堅(jiān) 唐歐杉 秦豐明 成銀宏 陳鐘良 陳麗娜 周浩亮 陶楓 童海江

亞甲基四氫葉酸還原酶基因C667T多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈慢血流現(xiàn)象的關(guān)系研究

吳堅(jiān) 唐歐杉 秦豐明 成銀宏 陳鐘良 陳麗娜 周浩亮 陶楓 童海江

目的 觀察亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T多態(tài)性與中國(guó)南方漢族人群中冠狀動(dòng)脈慢血流現(xiàn)象（CSFP）的關(guān)系，進(jìn)一步探討遺傳因素在CSFP發(fā)病中的意義。方法收集經(jīng)冠狀動(dòng)脈血管造影證實(shí)冠脈正常的患者214例作為研究對(duì)象，并利用校正的TIMI幀數(shù)法（CTFC）分組為慢血流組（143例）和對(duì)照組（71例），應(yīng)用焦磷酸測(cè)序法（Pyrosequencing）檢測(cè)患者C677T基因表型，分析MTHFR基因C677T多態(tài)性與CSFP的關(guān)系。結(jié)果慢血流組MTHFR基因（TT+TC）基因型和T等位基頻率均明顯高于對(duì)照組（69．2%、49．3%，χ2=8．05，P＜0．01；42．7%、29．6%，χ2=6．87，P＜0．01），慢血流組男性比例明顯高于對(duì)照組（59．4%、36．6%，χ2= 9．90，P＜0．01），同型半胱氨酸(Hcy)和尿酸(UA)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0．05或0．01），慢血流組葉酸(FA)和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯低于對(duì)照組（P＜0．05），Logistic回歸分析均顯示（TT+TC）基因型[OR=1．962，95%CI（1．049～3．669），P＜0．05]、Hcy水平升高 [OR=1．087，95%CI（1．012～1．168），P＜0．05]、男性 [OR=2．507，95%CI（1．347～4．664），P＜0．01]和UA水平升高[OR=1．008，95%CI（1．003～1．013），P＜0．01]患者CSFP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。結(jié)論MTHFR基因C677T多態(tài)性與CSFP發(fā)病相關(guān)，攜帶T等位基因可能是中國(guó)南方漢族人群冠狀動(dòng)脈慢血流現(xiàn)象發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。

冠狀動(dòng)脈慢血流現(xiàn)象 同型半胱氨酸 同型半胱氨酸代謝相關(guān)酶 基因多態(tài)性

冠狀動(dòng)脈慢血流現(xiàn)象（coronaryslow flow phenomenon，CSFP）被定義為一種在冠狀動(dòng)脈造影中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)心外膜冠狀動(dòng)脈存在明顯狹窄病變，而對(duì)比劑灌注遠(yuǎn)端血管延遲的現(xiàn)象。最早由Tambe等[1]在1972年報(bào)道了6例存在該現(xiàn)象的典型心絞痛患者。雖然截止目前關(guān)于該現(xiàn)象的研究數(shù)量有限，但主流觀點(diǎn)認(rèn)為微血管功能障礙是引發(fā)該現(xiàn)象的主要原因，而具體引起血管功能異常的因素尚處于不斷探索階段。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）作為一種含巰基氨基酸，在巰基氧化過(guò)程中產(chǎn)生具有內(nèi)皮毒性反應(yīng)的活性氧產(chǎn)物，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，而高Hcy血癥已被認(rèn)為是心血管相關(guān)疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，現(xiàn)已有少量研究[2-3]發(fā)現(xiàn)Hcy水平升高可能是CSFP發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，而亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸和Hcy代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶。本研究通過(guò)觀察研究對(duì)象中MTHFR基因C677T多態(tài)性，分析其與CSFP的關(guān)系，進(jìn)一步探索遺傳性因素在發(fā)病中所起作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2011-06—2013-06在我院因疑診冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病而行冠狀動(dòng)脈血管造影證實(shí)冠脈正常的患者214例作為研究對(duì)象，均為紹興地區(qū)及其鄰近區(qū)域漢族人，按校正的TIMI幀數(shù)法（CTFC）分為慢血流組143例和對(duì)照組71例。排除標(biāo)準(zhǔn)：充血性心力衰竭、心臟瓣膜性疾病、限制型心肌病、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、房室傳導(dǎo)異常、冠脈痙攣、冠脈瘤樣擴(kuò)張、冠脈彌漫性病變、正服用抗凝或抗血小板凝聚藥物、慢性肺部疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、結(jié)締組織疾病及可引起高血漿Hcy的相關(guān)疾病或在服用相關(guān)影響藥物。

1.2 冠狀動(dòng)脈血流測(cè)量方法 應(yīng)用PHILIPS Allura Xper FD20數(shù)字血管造影機(jī)，采用Judkins法，左前降支（LAD）、左回旋支（LCx）采集體位為右前斜30°，右冠狀動(dòng)脈（RCA）取左前斜50°，采集速度為15幀/s。按Gibson等[2]描述的CTFC由2位介入醫(yī)師分別觀察記錄血流幀數(shù)，結(jié)果取均值。記錄幀數(shù)以30幀/s校正。本研究慢血流入選標(biāo)準(zhǔn)：血管造影正常，任一血管血流幀數(shù)＞27（其中LAD血流幀數(shù)除以1.7校正）。

1.3 MTHFR基因型測(cè)定 采用生工生物（上海）有限公司的血液基因組DNA快速抽提試劑盒提取基因組DNA。參照 GenBank中 MTHFR基因序列，利用PRIMER5.0軟件設(shè)計(jì)包含C677T多態(tài)性位點(diǎn)的PCR引物：上游引物5′-TCA TCC CTA TTG GCA GGT TAC-3′，下游引物5′-CAA AGC GGA AGA ATG TGT CA-3′，測(cè)序引物5′-GAG AAG GTG TCT GCG GGA-3′，其中下游引物5′末端進(jìn)行生物素標(biāo)記；PCR反應(yīng)體系總體積為50μl，含5×Green Gotaq reaction Buffer 10μl，MgCl2（25mM）6μl，引物各0.5μl，dNTPs 1μl，TagDNA聚合酶1U，余用ddH2O補(bǔ)全。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸1min，16℃，終止反應(yīng)。利用PyroMark Q96 ID焦磷酸測(cè)序儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序。生物素及PCR反應(yīng)體系均為Promega公司產(chǎn)品。

1.4 臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定 所有患者在禁食至少8h基礎(chǔ)上抽取外周靜脈血進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)?？崭寡牵‵BG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）、Hcy均采用OLYMPUS AU2700+ISE大型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，其中Hcy測(cè)定采用循環(huán)酶法；纖維蛋白原（FIB）測(cè)定采用免疫比濁法；葉酸（FA）測(cè)定采用固相放免法；平均血小板體積（MPV）測(cè)定采用Coulter LH750血細(xì)胞分析儀。

1.5 心臟超聲指標(biāo)測(cè)定 利用西門(mén)子SEQUOIA 512彩色多普勒采集系統(tǒng)測(cè)定患者左室舒張末內(nèi)徑（LVEDd）和左室收縮功能（LVEF）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，連續(xù)性正態(tài)分布計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布連續(xù)計(jì)量資料采用M（QR）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。利用Pearson相關(guān)分析連續(xù)性變量間的相關(guān)性，而分類(lèi)變量采用Kendall’s tau-b方法。以是否為慢血流患者為應(yīng)變量，作多元逐步Logistic回歸分析（向后：Wald法），對(duì)CSFP影響因素進(jìn)行篩選。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基礎(chǔ)臨床資料比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的基礎(chǔ)臨床資料比較

由表1可見(jiàn)，兩組患者年齡、吸煙、飲酒、高血壓病、糖尿病、收縮壓及舒張壓差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而慢血流組男性比例顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。

2.2 臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)及CTFC比較 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，兩組患者TG、TC、LDL-C、FBG、Cr、FIB、MPV、LVEF、LVEDd無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，慢血流組Hcy高于對(duì)照組（P＜0.05），UA高于對(duì)照組（P＜0.01），HDLC、FA低于對(duì)照組（P＜0.05）。慢血流組3支血管CTFC均顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），兩組患者平均CTFC分別為37.6（32.3，45.5）和22.2（20.3，23.4）（P＜0.001）。2.3 MTHFR基因型比較 根據(jù)焦磷酸測(cè)序儀結(jié)果判斷基因型（圖1），慢血流組中CC、CT和TT基因型的頻率為30.8%、53.1%和16.1%，對(duì)照組中為50.7%、39.4%和9.9%，各組基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=1.067、0.202，P＞0.05）。其中慢血流組TT+ TC型頻率和T等位基因頻率均顯著高于對(duì)照組（χ2= 8.05、6.87，P＜0.01），詳見(jiàn)表3。

表2 兩組患者臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)及CTFC比較

表3 兩組患者基因型和等位基因頻率比較

2.4 單因素相關(guān)分析 平均CTFC與Hcy（r=0.380，P＜0.001）、男性（r=0.331，P＜0.001）、TT+TC基因型（r= 0.176，P＜0.05）和飲酒（r=0.169，P＜0.05）呈正相關(guān)、與FA（r=-0.315，P＜0.001）呈負(fù)相關(guān)；Hcy與TT+TC型呈正相關(guān)（r=0.171，P＜0.05），與FA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.508，P＜0.001）。

2.5 多元逐步Logistic回歸分析 以慢血流與否為應(yīng)變量，應(yīng)用單因素分析篩選出Hcy、性別（男性=1，女性= 0）、基因型（TT或TC=1，CC=0）、HDL-C、FA、UA進(jìn)入逐步回歸分析，結(jié)果示TT+TC基因型、Hcy、男性、UA與CSFP發(fā)病相關(guān)，詳見(jiàn)表4。

圖1 MTHFR C677T基因型焦磷酸測(cè)序結(jié)果（a）為CC基因型（b）為T(mén)T基因型（c）CT基因型

表4 CSFP發(fā)病影響因素的Logistic回歸分析

3 討論

截至目前尚沒(méi)有一個(gè)明確的機(jī)制來(lái)闡述冠狀動(dòng)脈慢血流現(xiàn)象是如何發(fā)生的，而冠脈微血管功能失調(diào)被認(rèn)為與CSFP有關(guān)。1996年Mangieri等[4]對(duì)慢血流患者的左室心肌活檢進(jìn)行了研究后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞水腫、毛細(xì)血管損傷和微血管管腔變小，進(jìn)一步電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核漿固縮等現(xiàn)象，他們推測(cè)以上改變使得遠(yuǎn)端血流阻力增加從而導(dǎo)致了血流減慢，支持了微循環(huán)阻力升高是慢血流現(xiàn)象主要原因的假說(shuō)。Sezgin等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CSFP患者存在內(nèi)皮功能失調(diào)，血漿一氧化氮（NO）水平和血流介導(dǎo)的血管擴(kuò)張較正常對(duì)照組顯著降低，可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能在冠脈微循環(huán)調(diào)節(jié)中也起到重要作用，故有相當(dāng)數(shù)量的研究圍繞內(nèi)皮細(xì)胞功能展開(kāi)，Tanriverdi等[6]發(fā)現(xiàn)CSFP患者丙二醛、超氧化物歧化酶水平增高，還原型谷胱甘肽水平減低，證實(shí)了高Hcy所致的高氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮功能，可能在CSFP發(fā)病中起一定作用。現(xiàn)有證據(jù)已經(jīng)明確Hcy可通過(guò)高氧化應(yīng)激反應(yīng)直接損傷血管內(nèi)皮功能，同時(shí)Hcy可抑制一氧化氮合酶的合成和活性、抑制L精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減少NO的生成，使NO降解增加，引起微血管舒張功能減退。本研究結(jié)果也同樣顯示，慢血流組Hcy水平明顯高于正常血流組。而多元逐步Logistic回歸分析也同樣顯示Hcy是CSFP發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。本研究的發(fā)現(xiàn)男性比女性更易發(fā)生CSFP，與Hawkins和Nie等[7-8]研究相同。Camsari等[9]借助超聲和IVUS發(fā)現(xiàn)CSFP患者冠脈存在彌漫性?xún)?nèi)膜增厚和（或）節(jié)段性鈣化，冠脈內(nèi)膜平均厚度均較對(duì)照組明顯增加。故這些學(xué)者認(rèn)為CSFP為早期動(dòng)脈粥樣硬化的一種表現(xiàn)形式。同時(shí)發(fā)現(xiàn)UA可能是CSFP發(fā)病的預(yù)測(cè)因素之一，與Yibliz等[10]研究結(jié)果相同。雖然慢血流組HDL-C較對(duì)照組明顯減少，與戴宇翔等[11]研究結(jié)果相同，多元回歸分析未支持其與CSFP發(fā)病相關(guān)。

已有研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因存在多種突變類(lèi)型，而C677T基因多態(tài)性是學(xué)者研究最多的，它是目前發(fā)現(xiàn)的MTHFR基因最常見(jiàn)的不耐熱錯(cuò)義突變，不易受外界環(huán)境的影響，是單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。MTHFR C677T突變使其活性下降，熱敏感性增高，從而使Hcy轉(zhuǎn)硫基和甲基化過(guò)程出現(xiàn)障礙而誘發(fā)Hcy升高。Arai等[12]的研究證實(shí)，TT基因型個(gè)體有較高的血漿Hcy水平。現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明MTHFR基因C677T基因多態(tài)性可能與多種疾病發(fā)病相關(guān)，其中就包括冠心病。歐洲9個(gè)國(guó)家一個(gè)協(xié)作項(xiàng)目對(duì)711例心血管患者和747例對(duì)照者進(jìn)行的研究表明，特別是當(dāng)血漿Hcy升高和葉酸降低時(shí)，MTHFR基因C677T突變T純合基因型是心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子[13]，而目前針對(duì)MTHFR基因突變與CSFP的相關(guān)性尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)慢血流組TT+TC型頻率要顯著高于對(duì)照組[OR=2.314，95%CI（1.289～4.155）]，T等位基因頻率也高于對(duì)照組[OR=1.771，95%CI（1.152～2.722）]。進(jìn)一步Logistic回歸分析同樣證明T等位基因攜帶者CSFP發(fā)病率增高 [OR=1.962，95%CI（1.049～3.669）]，表明攜帶T等位基因可能是CSFP發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。

本研究雖然發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T多態(tài)性可能是CSFP發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，但未入選如BMI等已知及其他未知的可能影響因素，有待進(jìn)一步研究作出解答報(bào)道。

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Association of MTHFR polymorphisms with risk of coronary slow flow phenomenon

Objective To investigate the association of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)C677T polymorphisms with risk of coronary slow flow phenomenon(CSFP)．MethodsOne hundred and forty three patients with CSFP and 71 controls were included in this study．CSFP were diagnosed by the corrected TIMI frame count method．The polymorphisms of MTHFR C677T were determined by pyrosequencing in two groups．ResultsThe TT and TC genotype frequency,and T allele frequency in CSFP patients were higher than those in the controls(69．2%,49．3%,χ2=8．05,P＜0．01;42．7%,29．6%,χ2=6．87,P＜0．01)．Male to female ratio was higher in CSFP group(59．4%,36．6%,χ2=9．90,P＜0．01)than in controls．Serum homoeysteine (Hcy)and uric acid(UA)levels were higher,folic acid and high-density lipoprotein cholesterol levels were lower in CSFP patients than those in controls(P＜0．05 and 0．01)．After other risk factors were adjusted,TT and TC genotype(OR=1．962,95%CI 1．049～3．669,P＜0．05),Hcy(OR=1．087,95%CI 1．012～1．168,P＜0．05),male sex(OR=2．507,95%CI 1．347～4．664,P＜0．01)and UA (OR=1．008,95%CI 1．003～1．013,P＜0．01)were independent risk factors for CSFP．ConclusionThe high frequency of allele T in MTHER gene C677T may be a risk factor for CSFP in the southern Chinese population．

Coronary slow flow Homocysteine Homocysteine metabolism related enzymes Gene polymorphism

2014-04-14）

（本文編輯：田云鵬）

浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)臨床科研基金項(xiàng)目（2011ZYC-A90）

312000 紹興第二醫(yī)院心血管內(nèi)科

唐歐杉，E-mail：tangoushan@medmail.com.cn