王浩 耿趙銘 胡智偉 咼登俊

丹皮酚抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

王浩 耿趙銘 胡智偉 咼登俊

目的 探討丹皮酚對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法采用不同濃度丹皮酚預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞，加入魚(yú)藤酮誘導(dǎo)建立帕金森?。≒D）神經(jīng)元損傷模型，以CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，組織活性氧熒光定量法（DCFH-DA法）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）生成，并以JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位（MMP），同時(shí)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（caspase-3）活性。結(jié)果1μmol/L魚(yú)藤酮處理24 h后SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性顯著降低，凋亡細(xì)胞數(shù)增多，ROS生成增加，MMP降低，caspase-3活性升高（均P＜0．01），說(shuō)明PD神經(jīng)元損傷模型建立成功。與魚(yú)藤酮處理組比較，丹皮酚(5、25μmol/L)預(yù)處理后SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性提高，凋亡細(xì)胞數(shù)減少，ROS生成受到抑制，MMP改善，而caspase-3活性降低（P＜0．05或0．01）。結(jié)論丹皮酚(5、25μmol/L)對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡具有抑制作用，其機(jī)制可能與丹皮酚的抗氧化作用等有關(guān)。

丹皮酚 魚(yú)藤酮 帕金森病 凋亡

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是中老年人常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著人口老齡化，PD發(fā)病率達(dá)1.00%～3.00%，并呈上升趨勢(shì)[1-2]。PD主要病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失，并伴有路易小體形成。臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫及姿態(tài)和步態(tài)異常等，部分患者還伴有焦慮抑郁、癡呆及自主神經(jīng)功能障礙等癥狀[2-5]。目前PD的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，有研究表明氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙在PD患者的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡中起重要作用[2-4]。

丹皮酚（paeonol）是從毛茛科植物牡丹和蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿全草中提取的中藥單體，具有抗氧化、抗過(guò)敏、抗炎等作用[6]。目前的體內(nèi)外研究均表明丹皮酚具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但其能否抑制PD患者的神經(jīng)元凋亡尚無(wú)報(bào)道。SH-SY5Y細(xì)胞屬于多巴胺能神經(jīng)元，已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)病理模型的建立。魚(yú)藤酮（rotenone）是一種線粒體復(fù)合物Ⅰ（complexⅠ）活性抑制劑，能夠誘導(dǎo)模擬PD的神經(jīng)元損傷病理生理改變，目前常用于PD的實(shí)驗(yàn)研究[7]。本研究采用魚(yú)藤酮誘導(dǎo)建立SHSY5Y細(xì)胞損傷模型，從細(xì)胞水平評(píng)價(jià)丹皮酚對(duì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.l試劑和儀器 SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；魚(yú)藤酮、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）、4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、JC-1等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丹皮酚注射液（主要成分為丹皮酚，10mg/2ml·支）購(gòu)自上海第一生化藥業(yè)公司，實(shí)驗(yàn)時(shí)以無(wú)菌培養(yǎng)液配置；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；caspase-3試劑盒購(gòu)自南京建成公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen公司。FACSalibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)Becton Dickinson產(chǎn)品，Elx800酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-TEK公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 SH-SY5Y細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至80.00%融合時(shí)1∶4傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、魚(yú)藤酮處理組、魚(yú)藤酮+丹皮酚預(yù)處理組(1、5和25μmol/L 3個(gè)濃度)共5組。細(xì)胞接種于96或24孔板中，接種密度為1×105/ml，24h后換液并加入不同濃度的丹皮酚，培養(yǎng)1h后分別加入終濃度為1μmol/ L魚(yú)藤酮，對(duì)照組加入正常培養(yǎng)液，維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 各組細(xì)胞接種于96孔板，分別處理達(dá)預(yù)定作用時(shí)間后每孔加入10μl CCK-8反應(yīng)液，37℃反應(yīng)10min后，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm的吸光值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞增殖活性（%）=（處理組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于100ml培養(yǎng)瓶中，待80.00%融合后分別予以不同處理，到達(dá)預(yù)定時(shí)間后消化、收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）生成 細(xì)胞分別予以不同處理，到達(dá)預(yù)定時(shí)間后消化、收集細(xì)胞，以無(wú)血清的培養(yǎng)液重懸并加入終濃度為10μmol/L的DCFH-DA，37℃避光孵育30min，離心洗滌細(xì)胞后，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm），ROS值（%）=（處理組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度）×100%。

1.6 JC-1檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位（MMP） 離心收集細(xì)胞后以PBS重懸，加入終濃度為10μg/ml的JC-1，置于37℃避光孵育30min，PBS洗滌2次后以熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)MMP變化（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm）。MMP（%）=（處理組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度）×100%。

1.7 細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性檢測(cè) 收集細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌后，細(xì)胞裂解液重懸，冰上孵育20min，14 000r/ min 4℃離心15min。取上清液用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，剩余上清液檢測(cè)caspase-3活性，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：取5μl上清液加入caspase-3熒光底物（AC-DEVDAMC）中，避光孵育90min，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)分析（激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)460nm），結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為每mg蛋白的熒光強(qiáng)度。計(jì)算公式caspase-3活性（%）=（處理組每mg蛋白熒光強(qiáng)度/對(duì)照組每mg蛋白熒光強(qiáng)度）×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚減輕魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性下降 在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用不同濃度魚(yú)藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷建立PD模型，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示魚(yú)藤酮1μmol/L作用24h后細(xì)胞增殖活性以及LDH釋放的變化較明顯（本文中未顯示相關(guān)結(jié)果），因此本研究選擇1μmol/L魚(yú)藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞PD樣損傷。不同濃度丹皮酚在魚(yú)藤酮處理前1h加入，維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，魚(yú)藤酮處理組細(xì)胞增殖活性下降（P＜0.01）；與魚(yú)藤酮處理組比較，丹皮酚（5、25μmol/L）處理后細(xì)胞增殖活性升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或0.01），而且隨著丹皮酚藥物濃度增加，保護(hù)作用隨之增強(qiáng)，見(jiàn)表1。

2.2 丹皮酚抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，1μmol/L魚(yú)藤酮處理后SHSY5Y細(xì)胞凋亡明顯增多（P＜0.01），而丹皮酚（5、25μmol/L）預(yù)處理則減少細(xì)胞凋亡，且隨著丹皮酚藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05或0.01），見(jiàn)表1。

表1 丹皮酚對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性與凋亡率變化的影響（%）

2.3 丹皮酚抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS產(chǎn)生 與對(duì)照組比較，魚(yú)藤酮誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的水平明顯升高（P＜0.01）；而與魚(yú)藤酮處理組比較，丹皮酚（5、25μmol/L）預(yù)處理可以明顯抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的ROS升高（P＜0.05或0.01），其中以25μmol/L組抑制效果更加明顯，見(jiàn)表2。

2.4 丹皮酚抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中MMP的下降 與對(duì)照組比較，魚(yú)藤酮處理組SH-SY5Y細(xì)胞MMP顯著下降（P＜0.01），提示線粒體能量耗竭；而與魚(yú)藤酮處理組比較，丹皮酚（5、25μmol/L）預(yù)處理可以明顯改善魚(yú)藤酮誘導(dǎo)MMP下降（P＜0.05或0.01），其中以25μmol/L組抑制效果更加明顯，見(jiàn)表2。

表2 丹皮酚對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS生成與MMP變化的影響（%）

2.5 丹皮酚抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞caspase-3活化 與對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞比較，魚(yú)藤酮處理組caspase-3活性上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[（100.00±5.64）%vs（131.88± 7.65）%，P＜0.01]。而1μmol/L丹皮酚預(yù)處理后細(xì)胞caspase-3活性為（122.20±7.51）%，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；而5μmol/L丹皮酚預(yù)處理后活性為（112.76±8.85）%，25μmol/L丹皮酚預(yù)處理后為（105.29±6.28）%，與魚(yú)藤酮處理組比較，（5、25μmol/L）丹皮酚預(yù)處理后細(xì)胞caspase-3活性受到抑制（P＜0.05或0.01），且以25μmol/L組效果更加明顯。

3 討論

PD是由多種因素共同所致的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失為主要病理特征，并伴有殘存神經(jīng)元內(nèi)路易小體形成[2-3]。PD的發(fā)生機(jī)制與遺傳因素、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥以及細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)，目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡是PD發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，因此如何減少神經(jīng)元凋亡已成為防治PD的研究熱點(diǎn)之一[2-4]。

丹皮酚是從毛茛科植物牡丹和蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿的全草中提取出來(lái)的中藥單體，具有抗氧化、抗炎、抗菌等藥理作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，能夠減輕血腦屏障通透性，抑制ROS生成[8-9]；同時(shí)丹皮酚還能減輕β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷[10]；并可以有效地改善腦缺血、糖尿病及阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知障礙[9-12]。此外，丹皮酚還能調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥[13]。目前，體內(nèi)外研究均表明丹皮酚具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但其對(duì)于神經(jīng)元凋亡是否存在保護(hù)作用尚未見(jiàn)于報(bào)道。

因此，本研究中采用魚(yú)藤酮建立PD神經(jīng)元損傷模型，探討了丹皮酚對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果提示丹皮酚對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞凋亡有一定程度的保護(hù)作用，并呈濃度效應(yīng)關(guān)系，以丹皮酚（5、25μmol/L）作用明顯。

在PD發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙在神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮了重要作用，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS可引起線粒體復(fù)合物Ⅰ（complexⅠ）功能障礙，而后者又會(huì)促進(jìn)ROS進(jìn)一步生成，兩者互相作用導(dǎo)致惡性循環(huán)[14]。線粒體是細(xì)胞凋亡的主要開(kāi)關(guān)，線粒體功能下降，不僅促使ROS生成增多，同時(shí)也會(huì)引起ATP合成減少，線粒體膜去極化，造成MMP下降及滲透性通道的開(kāi)放，進(jìn)一步將會(huì)引起細(xì)胞色素C釋放，繼而活化依賴于caspase的凋亡信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，影響組織器官功能[3,14-15]。本研究中以DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS生成，以JC-1檢測(cè)MMP來(lái)反映線粒體膜通透性的改變。結(jié)果顯示1μmol/L魚(yú)藤酮作用24 h，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多，MMP下降。而丹皮酚（5、25μmol/ L）預(yù)處理后可部分抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的ROS生成，并使MMP回升，筆者推測(cè)該效應(yīng)的部分機(jī)制與丹皮酚的抗氧化活性有關(guān)。

caspase-3是內(nèi)、外源性凋亡通路共有的終末效應(yīng)酶，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。正常狀態(tài)下以無(wú)活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在多種凋亡刺激信號(hào)作用下被活化，裂解相應(yīng)底物，最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生[3,16]。因此，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase-3活性也是凋亡檢測(cè)的重要手段之一。本研究結(jié)果表明魚(yú)藤酮處理后，SHSY5Y細(xì)胞caspase-3活性顯著上調(diào)，而丹皮酚預(yù)處理（5、25μmol/L）使caspase-3活性下降。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，魚(yú)藤酮通過(guò)促使ROS生成增多、MMP下降以及caspase-3活化等機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，而丹皮酚預(yù)處理可抑制以上效應(yīng)，該保護(hù)作用可能與丹皮酚抗氧化活性有關(guān)，而丹皮酚的具體神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚有待于進(jìn)一步深入研究。

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Paeonol prevents SH-SY5Y cells from rotenone-induced apoptosis

Objective To investigate the effects of paeonol on rotenone-induced apoptosis in SH-SY5Y cells．MethodsSH-SY5Y cells were pretreated with paeonol and then rotenone was added in the culture medium．Cell viability was detected by CCK-8 assay．The apoptosis rate was assessed by flow cytometry．Cellular ROS production were detected by DCFH-DA．The mitochondial membrane potential(MMP)was determined by JC-1 staining and the caspase-3 activity was measured by caspase-3 kit．Results1μmol/L rotenone significantly decreased cell viability,enhanced the apoptotic rate and overproduced ROS,reduced MMP and increased caspase-3 activity．Compared to rotenone treated group,5,25μmol/L paeonol significantly ameliorated cell damage,inhibited apoptotic rate and ROS overproduction,alleviated the decrease of MMP and reduced the caspase-3 activity．ConclusionPaeonol can prevent SH-SY5Y cells from apoptosis induced by rotenone,which may be associated with its anti-oxidant ability．

PaeonolRotenone Parkinson disease Apoptosis

2014-05-28）

（本文編輯：胥昀）

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y2110679）

310012 杭州，浙江省立同德醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（王浩、胡智偉、咼登俊）；濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系（耿趙銘）