張甘露 趙長(zhǎng)林

PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織中的表達(dá)及與患者預(yù)后的相關(guān)性分析

張甘露 趙長(zhǎng)林

目的 探討直腸癌組織PI3K和Akt蛋白表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性。方法應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)PI3K和Akt蛋白在60例直腸癌組織、30例直腸腺瘤組織及10例正常直腸黏膜組織中的表達(dá)，并對(duì)60例直腸癌患者進(jìn)行隨訪。結(jié)果PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織中均呈高表達(dá)，兩者表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0．05）。PI3K蛋白表達(dá)水平與患者術(shù)前CEA水平、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P＜0．05或0．01）；與年齡、性別、腫瘤部位及形態(tài)無關(guān)（均P＞0．05）。Akt蛋白表達(dá)與患者術(shù)前CEA水平、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P＜0．01）；與年齡、性別、腫瘤部位和形態(tài)、分化程度無關(guān)（均P＞0．05）。Cox回歸模型分析顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0．05）。結(jié)論P(yáng)I3K和Akt蛋白的高表達(dá)與直腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)并起協(xié)同作用。

直腸腫瘤 PI3K Akt預(yù)后

近年來，隨著人們生活水平的提高以及生活習(xí)慣的改變，直腸癌的發(fā)病率逐年增加。直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多步驟以及多因素協(xié)調(diào)累積的結(jié)果，涉及多個(gè)癌基因和抑癌基因及其調(diào)控信號(hào)通路的異常改變。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt/ PKB）信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化過程中起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察PI3K和Akt蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，探討其在直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用以及對(duì)患者預(yù)后的影響。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 收集大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院2006-01—2009-12手術(shù)切除的直腸癌組織蠟塊標(biāo)本60例，均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療及生物免疫治療，另收集直腸腺瘤組織蠟塊30例、正常直腸黏膜組織蠟塊10例，所有標(biāo)本病例資料齊全。直腸癌標(biāo)本中，男37例，女23例；年齡30～75歲，中位年齡53歲，其中≤60歲31例，＞60歲29例。腫瘤部位：上段（距肛緣＞7cm）9例，中下段（距肛緣＜7cm）51例；腫瘤形態(tài)：隆起型19例，潰瘍型41例；術(shù)前CEA：正常28例，升高32例；分化程度：高分化21例，中/低分化39例。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期38例；術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無23例，有37例；術(shù)前遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移：無44例，有16例。臨床病理分期按美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）/國(guó)際抗癌聯(lián)盟（ICC）結(jié)腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（2010年，第7版），病理診斷均由病理科資深醫(yī)師經(jīng)雙盲法核實(shí)確定。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備 即用型兔抗人PI3K單克隆抗體及兔抗人Akt單克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，工作濃度為1∶100。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測(cè)試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液（pH=6.0）與PBS磷酸鹽緩沖粉劑（pH= 7.4）均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟 本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化快捷型SP法。具體步驟：切片脫蠟水化，高壓抗原修復(fù)，3.00%過氧化氫孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，滴加一抗（PI3K/Akt）室溫孵育60min，PBS沖洗，滴加即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑，室溫孵育10min，PBS沖洗，滴加DAB溶液顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染并封片。采用抗體公司提供的已知陽性乳腺癌切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 PI3K和Akt蛋白均為胞質(zhì)表達(dá)，為棕黃色顆粒。陽性細(xì)胞必須具備：細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，陽性染色定位準(zhǔn)確，著色明顯高于背景。隨機(jī)選擇10個(gè)不同高倍鏡視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取其均值，按其中陽性細(xì)胞所占比例計(jì)分：陰性（-）：無棕黃色反應(yīng)，隨機(jī)視野中無陽性細(xì)胞；弱陽性（+）：均勻分布淺棕黃色反應(yīng)，陽性細(xì)胞比例＜25.00%；中等陽性（++）：深棕黃色反應(yīng)，陽性細(xì)胞比例25.00%～50.00%；強(qiáng)陽性（+++）：棕黑色反應(yīng)，陽性細(xì)胞比例＞50.00%。

1.5 隨訪 隨訪起始時(shí)間為手術(shù)時(shí)間，截止時(shí)間為2011-09-30，隨訪終點(diǎn)為患者死亡日期，隨訪方式采用門診復(fù)查及住院病歷、電話隨訪相結(jié)合的方式；中位隨訪時(shí)間為44.5個(gè)月（0.5～106個(gè)月），失訪5例，失訪率8.33%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)的校正公式及Fisher精確檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，以Long-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，以Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，得到患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織、直腸腺瘤組織及正常直腸黏膜組織中的表達(dá) PI3K蛋白在直腸癌組織、直腸腺瘤組織、正常直腸黏膜組織中陽性表達(dá)率分別為75.00%（45/60）、33.30%（10/30）、30.00%（3/ 10），直腸癌組織PI3K陽性表達(dá)率明顯高于直腸腺瘤組織和正常直腸黏膜組織（均P＜0.01）。Akt蛋白在直腸癌組織、直腸腺瘤組織、正常直腸黏膜組織中陽性表達(dá)率分別為60.00%（36/60）、33.30%（10/ 30）、10.00%（1/10），直腸癌組織Akt陽性表達(dá)率明顯高于直腸腺瘤組織和正常直腸黏膜組織（均P＜0.01），見圖1。

圖1 PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織、直腸腺瘤組織及正常直腸黏膜組織中的表達(dá)（A：PI3K在直腸癌組織中的表達(dá)；B：PI3K在直腸腺瘤組織中的表達(dá)；C：PI3K在正常直腸黏膜組織中的表達(dá)；D：Akt在直腸癌組織中的表達(dá)；E：Akt在直腸腺瘤組織中的表達(dá)；F：Akt在正常直腸黏膜組織中的表達(dá)；免疫組化SP法，×100）

2.2 PI3K和Akt蛋白表達(dá)的相關(guān)性 60例直腸癌標(biāo)本中，PI3K和Akt蛋白同時(shí)表達(dá)陽性者占51.67%（31/ 60），同時(shí)表達(dá)陰性者16.70%（10/60），PI3K蛋白陽性而Akt蛋白陰性者23.30%（14/60），PI3K蛋白陰性而Akt蛋白陽性者8.30%（5/60）。Spearman相關(guān)分析提示，PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.314，P＜0.05）。

2.3 PI3K和Akt蛋白表達(dá)與直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，直腸癌組織中PI3K蛋白表達(dá)水平與術(shù)前CEA水平、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P＜0.05或0.01）；與年齡、性別、腫瘤部位及形態(tài)無關(guān)（均P＞0.05）。Akt蛋白表達(dá)水平與術(shù)前CEA水平、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P＜0.01）；與患者的年齡、性別、腫瘤部位和形態(tài)、分化程度無顯著相關(guān)性（均P＞0.05），見表1。

2.4 直腸癌患者PI3K和Akt蛋白表達(dá)的單因素生存分析 經(jīng)Kaplan-Meier生存分析，PI3K和Akt蛋白表達(dá)、腫瘤形態(tài)、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與直腸癌患者生存期相關(guān)（均P＜0.05或0.01），而年齡、性別、腫瘤部位、術(shù)前CEA及臨床分期與直腸癌患者生存期無顯著相關(guān)性（均P＞0.05），見表2及圖2-4。

2.5 多因素生存分析 Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)只有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），而PI3K和Akt蛋白表達(dá)不影響直腸癌患者的生存期（均P＞0.05），見表3。

表1 直腸癌組織PI3K和Akt蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

3 討論

PI3K-Akt信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖、分化及代謝方面密切相關(guān)，該通路的異?；罨谀[瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。PI3K是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的脂類第二信使，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成[1]。PI3K可分為3類，其結(jié)構(gòu)與功能各異，其中研究最廣泛的為Ⅰ類PI3K，此類PI3K為異源二聚體，由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基p85和一個(gè)催化亞基p110組成[2]。調(diào)節(jié)亞基含SH2、 SH3結(jié)構(gòu)域，與含有相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的靶蛋白相作用。多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、血管生成素（Ang1）和胰島素都能啟動(dòng)PI3K的激活過程。當(dāng)PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基被募集到臨近細(xì)胞膜的部位，p110亞基通過與p85亞基結(jié)合將底物磷脂酰肌醇2磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3磷酸（PIP3）。PIP3可以和蛋白激酶B（PKB）的N端PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的輔助下，通過使Akt蛋白上的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（Thr 308）和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（Ser 473）磷酸化而使其激活。Liu等[3]的研究顯示PI3K在胃癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中均高表達(dá)。Johnson等[4]的研究顯示PI3K和Akt蛋白在直腸癌組織中高表達(dá)，本研究也提示，直腸癌組織PI3K陽性表達(dá)率明顯高于正常直腸黏膜組織和直腸腺瘤組織。這表明PI3K的表達(dá)與直腸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

表2 PI3K和Akt蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

圖2 PI3K不同表達(dá)的直腸癌患者的生存曲線

圖3 Akt不同表達(dá)的直腸癌患者的生存曲線

圖4 有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移直腸癌患者的生存曲線

表3 Cox多因素生存分析

Akt是一個(gè)在進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K下游主要的效應(yīng)物。Akt可分為3種亞型（Akt1、Akt2、Akt3或PKBα、PKBβ、PKBγ）?；罨腁kt通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。持續(xù)激活的Akt主要作用于抗凋亡通路，拮抗由人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。PTEN是一種腫瘤抑制基因，位于人染色體10q23，具有磷酸酶的雙重活性，負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路的活性[5]。

伏代剛等[6]研究顯示潰瘍性結(jié)腸炎及直腸癌患者中Akt蛋白表達(dá)均高于正常組織，隨著潰瘍性結(jié)腸炎病程的進(jìn)展，Akt蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，由此認(rèn)為在潰瘍性結(jié)腸炎-腫瘤的疾病演進(jìn)過程中，Akt蛋白表達(dá)的增強(qiáng)可能與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生及癌變相關(guān)，Akt蛋白可能成為直腸癌早期的生物標(biāo)志物。殷舞等[7]的研究發(fā)現(xiàn)PI3K和Akt蛋白在大腸癌腺瘤性轉(zhuǎn)化中表達(dá)異常，與腺瘤的癌變進(jìn)展有關(guān)，其表達(dá)強(qiáng)度隨腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化而增加，在腺癌中表達(dá)最強(qiáng)，這提示了Akt在直腸癌的發(fā)生中起重要作用。本研究結(jié)果顯示直腸癌組織中PI3K和Akt蛋白陽性表達(dá)率與直腸腺瘤組織和正常直腸黏膜組織相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且直腸癌組織中PI3K與Akt蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，這與Baba等[8]的相關(guān)研究結(jié)果一致，提示PI3K-Akt信號(hào)通路在直腸癌組織中過度激活，可能在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用。在患者的臨床病理特征方面，此通路過度活化與直腸癌患者術(shù)前CEA水平、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，其中PI3K蛋白過表達(dá)還與分化程度有關(guān)，而與其他病理因素?zé)o明顯相關(guān)性，提示PI3K-Akt信號(hào)通路的過度表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)并可能影響到患者的預(yù)后。

關(guān)于直腸癌預(yù)后影響因素的分析也是近年來研究的熱點(diǎn)。有報(bào)道顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響大腸癌患者預(yù)后的最重要因素。易呈浩等[9]研究顯示腫瘤浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)、送檢標(biāo)本淋巴結(jié)總數(shù)、鄰近器官受累、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。汪建平等[10]的研究顯示腫瘤的大體分型、分化程度是影響結(jié)、直腸癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立因素。Baba等[8]的研究顯示Akt是影響直腸癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Cai等[11]的薈萃分析顯示Akt蛋白表達(dá)與卵巢癌的總生存期及無病進(jìn)展時(shí)間有關(guān)，但現(xiàn)有的證據(jù)不足以支持PI3K-Akt作為臨床實(shí)踐中判斷患者預(yù)后的影響因子。在本研究中，PI3K蛋白及Akt蛋白表達(dá)、腫瘤形態(tài)、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與直腸癌患者生存期相關(guān)，而年齡、性別、腫瘤部位、術(shù)前CEA及臨床分期與直腸癌患者生存無顯著相關(guān)性，進(jìn)一步采用Cox回歸模型多因素分析發(fā)現(xiàn)只有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。PI3K和Akt蛋白表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性目前仍存在爭(zhēng)議，需要更多的臨床資料及數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究。

PI3K-Akt信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)是必要的，其活化與腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性提示以該信號(hào)通路為靶點(diǎn)的研究將有可能提高惡性腫瘤臨床治療的效果。隨著對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路分子機(jī)制研究以及對(duì)該信號(hào)通路在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制的深入研究，在不久的將來，以PI3K-Akt通路為靶點(diǎn)的藥物將在腫瘤的臨床治療中發(fā)揮越來越重要的作用。

[1]Vogt P K,Hart J R,Gymnopoulos M,et al．Phosphatidylinositol 3-kinase:the oncoprotein[J]．Curr Top Microbiol Immunol,2010, 347:79-104．

[2]Vogt P K,Kang S,Elsliger M A,et al．Cancer-specific mutations in phosphatidylinositol 3-kinase[J]．Trends Biochem Sci,2007,32(7): 342-349．

[3]Liu J F,Zhou X K,Chen J H,et al．Up-regulation of PIK3CA promotes metastasis in gastric carcinoma[J]．World J Gastroenterol, 2010,16(39):4986-4991．

[4]Johnson S M,Gulhati P,Rampy B A,et al．Novel expression patterns of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway components in colorectal cancer[J]．J Am Coll Surg,2010,210(5):767-778．

[5]Stiles B L．Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10:extending its PTENtacles[J]．Int J Biochem Cell Biol, 2009,41(4):757-761．

[6]伏代剛,黃曉麗,甘華田,等．PTEN/PI3K/AKT在潰瘍性結(jié)腸炎炎癥-腫瘤序列演進(jìn)中的作用[J]．四川大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2009,40(6):1021-1023．

[7]殷舞,鐘曉剛,黃順榮,等．PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在大腸癌腺瘤惡性轉(zhuǎn)化中的表達(dá)及意義[J]．廣東醫(yī)學(xué),2013,34(2):238-240．

[8]Baba Y,Nosho K,Shima K,et al．Phosphorylated AKT expression is associated with PIK3CA mutation,low stage,and favorable outcomein717colorectalcancers[J]．Cancer,2011,117(7):1399-1408．

[9]易呈浩,葛維挺,黃彥欽,等．1 368例結(jié)直腸癌TNM分期及預(yù)后分析[J]．中國(guó)腫瘤雜志,2012,39(3):597-601．

[10]汪建平,楊祖立,王磊,等．結(jié)直腸癌臨床病理特征與預(yù)后的多因素回歸分析[J]．中華腫瘤雜志,2003,25(1):59-61．

[11]Cai J,Xu L,Tang H,et al．The Role of the PTEN/PI3K/Akt pathway on prognosis in epithelial ovarian cancer:a meta-analysis[J]．Oncologist,2014,19(5):528-535．

Expression of PI3K and Akt proteins in rectal cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of PI3K and Akt proteins in rectal cancer and its clinicopathological significance．MethodsPI3K and Akt proteins were stained immunohistochemically in 60 samples of rectal cancer,30 samples of rectal adenoma and 10 samples of normal rectal mucosa．ResultsBoth PI3K and Akt were highly expressed in rectal carcinoma tissue,and correlated with each other(P＜0．05)．The expression of PI3K was correlated with preoperative CEA level,tumor differentiation,clinical stage,lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0．05 or 0．01),but not correlated with gender,age,tumor morphology and location(P＞0．05)．The expression of Akt was correlated with preoperative CEA level,clinical stage,lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0．01),but not correlated with gender,age,tumor morphology,location and differentiation(P＞0．05)．Multivariate analysis identified that distant metastasis was the independent prognostic factor for rectal cancer(P＜0．05)．ConclusionPI3K and Akt proteins are highly expressed in rectal cancer and correlated with clinicopathological features of patients．

Rectal neoplasma PI3K AktPrognosis

2014-03-05）

（本文編輯：胥昀）

310013 杭州，浙江醫(yī)院腫瘤科（張甘露）；大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院腫瘤科（趙長(zhǎng)林）

趙長(zhǎng)林，E-mail:zhongliuke2@163.com