許嵩 張治芬

M-CSF對人卵巢顆粒細(xì)胞表達FSH與其受體的影響及相互作用研究

許嵩 張治芬

目的 通過研究巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）對卵巢顆粒細(xì)胞表達卵泡刺激素（FSH）與其受體（FSHR）的影響及其與FSH之間的相互作用，探討M-CSF在卵泡發(fā)育中的作用。方法體外培養(yǎng)人卵巢腫瘤顆粒細(xì)胞系COV434，分別給予不同濃度的M-CSF（0、5、10、25、50、100ng/ml）進行干預(yù)，24h后收取細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，用熒光定量PCR法檢測顆粒細(xì)胞內(nèi)FSH受體表達量的變化，并用同法檢測FSH對M-CSF及其受體M-CSFR的作用。用ELISA方法對上清液中細(xì)胞分泌的雌二醇（E2）進行檢測，觀察M-CSF對顆粒細(xì)胞分泌E2的影響。結(jié)果M-CSF可使顆粒細(xì)胞FSHR的表達上升，呈劑量依賴性，當(dāng)M-CSF濃度＞10ng/ml時，上升更為明顯（P＜0.01）；FSH可以提升M-CSF及其受體在顆粒細(xì)胞內(nèi)的表達，但當(dāng)FSH濃度過高時（＞50ng/ml），此作用消失；M-CSF和FSH在體外條件下達到一定濃度后可以促進E2的分泌。結(jié)論M-CSF能夠促進顆粒細(xì)胞表達FSH受體和分泌E2，協(xié)助FSH發(fā)揮促卵泡發(fā)育的作用。

卵泡刺激素 巨噬細(xì)胞集落刺激因子 雌二醇 顆粒細(xì)胞 COV434

細(xì)胞因子可以通過自分泌或旁分泌的途徑調(diào)節(jié)卵巢功能。巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF），也稱CSF-1，是細(xì)胞信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的主要因子，具有多種生物學(xué)功能，近年來受到廣泛重視[1]。M-CSF可以由多種細(xì)胞產(chǎn)生，除了促進單核巨噬細(xì)胞生長、增殖、分化之外，還參與調(diào)控胚胎發(fā)育和骨代謝。現(xiàn)已證明，M-CSF在腫瘤、心血管疾病及一些自身免疫性疾病的發(fā)生過程中起作用。而生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，M-CSF也被發(fā)現(xiàn)其可能具有維持卵巢功能和促進性激素分泌的重要調(diào)控作用[2]。卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）是一種十分重要的促性腺激素，可以促進卵泡顆粒細(xì)胞的生長和成熟。因此，F(xiàn)SH在卵泡的局部濃度及其受體——FSHR（follicle stimulating hormone receptor）在顆粒細(xì)胞上的表達情況直接關(guān)乎卵泡發(fā)育的結(jié)果。本研究旨在探索M-CSF在卵泡發(fā)育時對FSH及其受體FSHR的影響，同時對兩者之間作用機制作初步探討。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑 人卵巢顆粒細(xì)胞系COV434購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；重組人M-CSF為美國R&D公司產(chǎn)品；人重組FSH為美國Sigma公司產(chǎn)品；RNA提取試劑TRziol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；SYBR熒光定量PCR試劑盒（產(chǎn)品編號DRR037、DRR420）為大連寶生物公司（TaKaRa Dalian）產(chǎn)品；人雌激素（雌二醇，E2）ELISA試劑盒為美國Biocheck公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)所用DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清為美國GIbco公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) COV434細(xì)胞以DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37°C、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)基內(nèi)含10%新生牛血清、青霉素100U/ml和鏈霉素100μg/ml。待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，以3×106密度種植于十二孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24h后換液，去血清并加入不同濃度的M-CSF（0、5、10、25、50、100ng/ml）或FSH（0、5、10、25、50、100ng/ml），再隔24h后收取上清液和細(xì)胞待測。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/）得到M-CSF、M-CSFR、FSHR基因的cDNA序列及其相關(guān)信息，采用Oligo6.0軟件設(shè)計引物，序列見表1。

表1 實驗引物序列

1.4 M-CSF、M-CSFR、FSHR基因表達量鑒定 采用TRizol法從培養(yǎng)的COV434細(xì)胞中提取總RNA，Nanopo儀器定量測定后，取1μg總RNA，按照TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒DRR037操作說明書，轉(zhuǎn)錄成cDNA，再按照TAKARA熒光定量PCR試劑盒DRR420的操作說明配置反應(yīng)體系；在BioRAD實時熒光定量PCR儀器上進行檢測，反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性2min，再進行95°C持續(xù)10s、60°C持續(xù)30s共39個循環(huán)。

1.5 E2測定 取細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，用Biocheck公司生產(chǎn)的E2ELISA試劑盒檢測。操作：稀釋試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上加標(biāo)準(zhǔn)品50μl，待測孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30min。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，加洗滌液，靜置30s后棄去，重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白除外。溫育后顯色以空白孔調(diào)零，450nm波長酶標(biāo)儀依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，測得計量資料以表示，組間比較采用方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 M-CSF作用對顆粒細(xì)胞表達FSHR的影響 經(jīng)不同濃度M-CSF作用24h后，顆粒細(xì)胞FSHR的表達與空白對照相比均有上升，濃度達到10ng/ml以上時，上升更為明顯（P＜0.01），見圖1。

圖1 M-CSF作用對顆粒細(xì)胞表達FSHR的影響（與空白對照比較，*P＜0.01）

2.2 FSH對顆粒細(xì)胞表達M-CSF及其受體M-CSFR的影響 經(jīng)過不同濃度FSH刺激24h后發(fā)現(xiàn)：當(dāng)FSH濃度為10、25ng/ml時，M-CSF及M-CSFR的表達量明顯增加（均P＜0.01），而當(dāng)FSH濃度升高至50ng/ml以上時，兩者的表達量則迅速下降，見圖2-3。

2.3 M-CSF和FSH分別對顆粒細(xì)胞分泌E2的影響 M-CSF和FSH作用后人顆粒細(xì)胞分泌E2均增加，這一作用在FSH或M-CSF濃度達到25ng/ml后更為明顯（均P＜0.05），而且隨著濃度的增加而逐漸增強，見圖4-5。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)卵巢功能的作用[3]。M-CSF可以由多種細(xì)胞產(chǎn)生，發(fā)揮多項生物學(xué)作用，如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]、自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）[5]、脂代謝疾病[6-7]等。在卵巢顆粒細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)存在合成M-CSF的mRNA。這提示在卵泡內(nèi)環(huán)境中可能存在自分泌或旁分泌途徑積累的M-CSF。卵泡發(fā)育時，其周圍存在的巨噬細(xì)胞可以促進顆粒細(xì)胞生長[8]。當(dāng)M-CSF基因發(fā)生無效突變時，不能形成生理性的黃體生成素（luteinizing hormone，LH）峰，小鼠會發(fā)生青春期延遲和嚴(yán)重的生育能力降低[9-10]。而給這些小鼠注射人重組M-CSF后，就可以恢復(fù)生殖性腺軸的正常反饋[11]。這一現(xiàn)象提示M-CSF基因的功能發(fā)揮與生殖性腺軸之間有重要的關(guān)系[12]。

M-CSF可以影響包括女性生殖系統(tǒng)的細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型[13]，顆粒細(xì)胞內(nèi)存在合成M-CSF的mRNA，缺乏M-CSF就會造成卵泡發(fā)育異常和排卵障礙，這種情況很可能與生殖性腺軸反饋異常相關(guān)，而促性腺激素受體FSHR則是卵泡發(fā)育所必需的特異性受體。本研究利用COV434細(xì)胞系，探討在非黃素化的顆粒細(xì)胞中，M-CSF對于其表達FSHR的影響。實驗結(jié)果表明，MCSF可以促進顆粒細(xì)胞上FSH受體的合成，而且這一效果呈劑量依賴性，M-CSF的濃度越高，其促進FSHR表達的作用就越強。說明在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞可以通過自分泌途徑產(chǎn)生M-CSF并不斷積累，通過它作用于發(fā)育中的卵泡，使其表達的FSHR不斷提高，協(xié)助應(yīng)答FSH的促卵泡發(fā)育作用，使顆粒細(xì)胞對于FSH的刺激作用更加敏感，從而促進卵泡發(fā)育成熟和排卵。Nishimura等[14]的動物實驗佐證了這一結(jié)論：在促性腺激素處理的未成熟小鼠中，M-CSF能誘發(fā)排卵。

圖2 FSH對顆粒細(xì)胞表達M-CSF的影響（與空白對照比較，*P＜0.01）

圖3 FSH對顆粒細(xì)胞表達M-CSFR的影響（與空白對照比較，*P＜0.01）

圖4 FSH對顆粒細(xì)胞分泌E2的影響（與空白對照比較，*P＜0.05）

圖5 M-CSF對顆粒細(xì)胞分泌E2的影響（與空白對照比較，*P＜0.05）

另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH也會影響顆粒細(xì)胞內(nèi)M-CSF及其受體的表達。當(dāng)FSH濃度較低時會促進M-CSF及其受體合成，呈正反饋表現(xiàn)，說明FSH亦會通過M-CSF促進其自身的受體——FSHR的生成，在一定程度上具備協(xié)助顆粒細(xì)胞應(yīng)答促性腺激素功能，但是若M-CSF的基因表達出現(xiàn)異常時，這一作用就會相應(yīng)消失。Akihisa等[15]在不孕癥的治療中對卵巢低反應(yīng)的患者進行了小規(guī)模M-CSF的臨床應(yīng)用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時使用M-CSF和hMG能比單用hMG使患者的卵泡發(fā)育得更好，尤其是在早卵泡期血清M-CSF水平較低的患者中，這一效果會表現(xiàn)得更加明顯，此研究既說明了促性腺激素與M-CSF之間確實存在相互輔助的調(diào)節(jié)作用，同時更是第一次在臨床治療中驗證了M-CSF的可行性。然而，在本實驗中亦發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FSH濃度升高到一定程度后（＞50ng/ml），它對于M-CSF及其受體的促進作用變得減弱甚至消失。分析這一現(xiàn)象的出現(xiàn)，可能是由于在卵泡發(fā)育的早期階段，垂體分泌的FSH作用于卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞，通過促進M-CSF的作用促進其自身受體FSHR的表達，協(xié)助卵泡在促性腺激素的作用下逐步發(fā)育成熟至竇狀卵泡。但隨著時間的推移，卵泡不斷增大，卵泡內(nèi)FSH的水平越來越高，此時為了避免M-CSF在其促進作用下發(fā)揮出其他的生物學(xué)效應(yīng)（如誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集等），F(xiàn)SH則會抑制M-CSF及其受體的表達，從而維持一定的穩(wěn)態(tài)。同時，本實驗也同樣發(fā)現(xiàn)，M-CSF具有促進顆粒細(xì)胞合成E2的作用，這一結(jié)果提示我們，M-CSF除了影響促性腺激素的受體之外，還可以通過升高E2的水平，輔助卵巢對生殖性腺軸中的下丘腦和垂體發(fā)揮正反饋作用?；贛-CSF在卵泡發(fā)育和排卵過程中的重要作用，有學(xué)者提出，可以把不孕癥患者體內(nèi)M-CSF的水平作為一個判斷輔助生殖治療是否成功的預(yù)測指標(biāo)[16-17]。

結(jié)合本研究以及近年的一些研究結(jié)果可知，M-CSF在排卵前卵泡發(fā)育、排卵時誘發(fā)排卵和排卵后黃體功能的維持上都有著重要的生物學(xué)功能，甚至有學(xué)者發(fā)現(xiàn)M-CSF還可以通過支持滋養(yǎng)細(xì)胞的生長和分化從而調(diào)節(jié)胎盤功能，叢而維持正常妊娠[18]，甚至有人認(rèn)為其在胚胎發(fā)育上也有重要調(diào)節(jié)作用[19]。可見M-CSF是生殖生理中不可或缺的重要組成部分，在生殖內(nèi)分泌學(xué)上具有廣闊的應(yīng)用前景，有必要對其繼續(xù)進行深入探討，從而為將來在臨床上應(yīng)用M-CSF治療不孕癥和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等疾病成為可能。

[1]Zhu H,Jiang X X,Guo Z K,et al.Tumor necrosis factor-alpha alters the modulatory effects of mesenchymal stem cells on osteoclast formation and function[J].Stem Cells Dev,2009,18(10):1473-1484.

[2]Zhang Z,Fang Q,Wang J.Involvement of macrophage colonystimulating factor(M-CSF)in the function of follicular granulosa cells[J].Fertil Steril,2008,90(3):749-754.

[3]Nishimura K,Tanaka N,Kawano T,et al.Changes in macrophage colony-stimulating factor concentration in serum and follicular fluid in in-vitro fertilization and embryo transfer cycles[J].Fertil Steril,1998,69(1):53-57.

[4]Abraham D,Zins K,Sioud M,et al.Stromal cell-derived CSF-1 blockade prolongs xenograft survival of CSF-1-negative neuroblastoma[J].Int J Cancer,2010,126(6):1339-1352.

[5]Hamilton J A.Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity[J].Nat Rev Immunol,2008,8(7):533-544.

[6]Weisberg S P,McCann D,Desai M,et al.Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue[J].J Clin Invest, 2003,112(12):1796-1808.

[7]Pang C,Gao Z,Yin J,et al.Macrophage infiltration into adipose tissue may promote angiogenesis for adipose tissue remodeling in obesity[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2008,295(2):E313-322.

[8]Fukumatsu Y,Katabuchi H,Naito M,et al.Effect of macrophages on proliferation of granulosa cells in the ovary in rats[J].J Reprod Fertil,1992,96(1):241-249.

[9]Chitu V,Stanley E R.Colony-stimulating factor-1 in immunity and inflammation[J].Curr Opin Immunol,2006,18(1):39-48.

[10]Sweet M J,Hume D A.CSF-1 as a regulator of macrophage activation and immune responses[J].Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2003,51(3):169-177.

[11]Cohen P E,Zhu L,Nishimura K,et al.Colony-stimulating factor 1 regulation of neuroendocrine pathways that control gonadal function in mice[J].Endocrinology,2002,143(4):1413-1422.

[12]Pollard J W.Trophic macrophages in development and disease [J].Nat Rev Immunol,2009,9(4):259-270.

[13]Arceci R J,Pampfer S,Pollard J W.Expression of CSF-1/c-fms and SF/c-kit mRNA during preimplantation mouse development [J].Dev Biol,1992,151(1):1-8.

[14]Nishimura K,Tanaka N,Ohshige A,et al.Effects of macrophage colony-stimulating factor on folliculogenesis in gonadotrophinprimed immature rats[J].J Reprod Fertil,1995,104(2):325-330.

[15]Takasaki A,Ohba T,Okamura Y,et al.Clinical use of colonystimulating factor-1 in ovulation induction for poor responders [J].Fertil Steril,2008,90(6):2287-2290.

[16]Salmassi A,Mettler L,Jonat W,et al.Circulating level of macrophage colony-stimulating factor can be predictive for human in vitro fertilization outcome[J].Fertil Steril,2010,93(1):116-123.

[17]Salmassi A,Zhang Z,Schmutzler A G,et al.Expression of mRNA and protein of macrophage colony-stimulating factor and its receptor in human follicular luteinized granulosa cells[J].Fertil Steril,2005,83(2):419-425.

[18]Pollard J W,Bartocci A,Arceci R,et al.Apparent role of the macrophage growth factor,CSF-1,in placental development[J]. Nature,1987,330(6147):484-486.

[19]Bartocci A,Mastrogiannis D S,Migliorati G,et al.Macrophages specifically regulate the concentration of their own growth factor in the circulation[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1987,84(17):6179-6183.

Effect of macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)on expression of follicle stimulating hormone(FSH)and its receptor in human granulosa cells

Objective To examine the effect of macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)on the expression of follicle stimulating hormone(FSH)and its receptor(FSHR)in human non-luteinizing granulosa cells.MethodsThe cultured human ovarian granulosa cell tumor COV434 cells were treated with different concentrations of M-CSF(0,5,10,25,50,100ng/ml).After 24 h,granulosa cells were collected and the mRNA expression of FSHR,M-CSF and M-CSF receptor was detected by quantitative PCR.Estradiol(E2)contents in culture supernatant were measured by ELISA.ResultsM-CSF significantly increased the mRNA expression of FSHR in a dose dependent manner(P＜0.01),it was more markedly when the concentration of M-CSF was＞10ng/ml.FSH enhanced the production of M-CSF and its receptor when the concentration＜50ng/ml.Both M-CSF and FSH increased the secretion of E2in granulosa cells.ConclusionM-CSF can increase the expression of FSHR and E2 secretion in human granulosa cell,which may promote follicular development.

FSHM-CSFEstradiolGranulosa cellCOV434

2014-03-11）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省自然科學(xué)基金（Y2090796）

310002 杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院（杭州市第一人民醫(yī)院集團）婦科

張治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn