王榮 費小陽 王麗卿 鄒立波

對廢棄胚胎行囊胚培養(yǎng)在體外受精-胚胎移植中的意義

王榮 費小陽 王麗卿 鄒立波

目的 探討對不可移植的廢棄胚胎行囊胚培養(yǎng)在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）中的意義。方法通過囊胚序貫培養(yǎng)法將d3廢棄胚胎培養(yǎng)至囊胚期。比較不同來源胚胎及d3胚胎的卵裂球數(shù)與囊胚形成的關系；利用廢棄胚胎囊胚形成情況對體外受精妊娠結局進行預測；并將獲得的可移植囊胚行胚胎移植及冷凍。結果共收集782例患者的1 962個廢棄胚胎，經序貫培養(yǎng)，形成囊胚376枚（19.2%）；1PN胚胎、0PN胚胎、d 3卵裂球數(shù)＞6的胚胎囊胚形成率較高（均P＜0.05）；廢棄胚胎中有囊胚形成者的臨床妊娠率明顯高于無囊胚形成者（P＜0.05）；由2PN胚胎形成囊胚共64枚，其中10枚囊胚行移植，剩余囊胚行玻璃化冷凍保存，囊胚移植后臨床妊娠率66.7%。解凍移植囊胚24個周期，妊娠周期13個，妊娠率54.2%。囊胚移植共獲得健康嬰兒18名。結論

體外受精-胚胎移植 廢棄胚胎 囊胚 序貫培養(yǎng)

目前，體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術作為不孕癥的主要治療方法之一已被廣泛開展。在IVF-ET治療過程中，存在大量不可用于移植的廢棄胚胎，嚴重限制了胚胎利用率。有報道顯示，廢棄胚胎可用于建立人類胚胎干細胞系，但仍有許多生殖醫(yī)學中心不具備干細胞培養(yǎng)技術，因此，對于IVF治療中廢棄胚胎的處理仍未見系統(tǒng)全面的報道。我們采用商品化的囊胚培養(yǎng)液對d3廢棄胚胎進行囊胚培養(yǎng)，比較不同來源胚胎囊胚形成的數(shù)量和質量，并對部分無可用卵裂期胚胎移植的患者進行囊胚移植，以期提高胚胎的利用率，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集我院生殖醫(yī)學中心2007-06—2010-06行IVF/卵母細胞質內單精子注射（ICSI）-ET周期新鮮廢棄胚胎。按照以下卵裂期胚胎評分進行對d3胚胎進行評價（表1）。

表1 卵裂期胚胎評分標準

本研究選擇的胚胎包括：（1）受精異常胚胎：無原核（0PN）、單個原核（1PN）和多個原核（≥3PN，以3PN為主）；（2）卵裂期發(fā)育延緩：不符合移植和冷凍標準的2原核（2PN）胚胎（均為d2仍是2PN，d3開始卵裂的胚胎）；（3）廢棄胚胎：主要為Ⅳ級不可移植及冷凍胚胎。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署“自愿將胚胎用于科學研究的知情同意書”。

1.2 囊胚培養(yǎng)及觀察 將囊胚培養(yǎng)液（Multiblast Medium，美國Irvine公司產品）在35 mm的培養(yǎng)皿中做30μl的微滴,覆蓋礦物油，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜。將d3廢棄胚胎在囊胚培養(yǎng)液中漂洗后，轉移到新鮮囊胚培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)至d5～7，觀察胚胎發(fā)育情況，根據(jù)Gamder囊胚分級法對形成的囊胚進行分級。先根據(jù)囊胚的擴張和孵出程度將囊胚分成6級：1級，早期囊胚，囊胚腔體積＜囊胚總體積的一半；2級，囊胚腔體積＞囊胚總體積的一半：3級，完全擴張囊胚，囊胚腔占據(jù)整個囊胚；4級，擴張后囊胚，囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴大，透明帶變??；5級，正在孵化的囊胚，囊胚正在從透明帶破裂口孵出；6級，孵化出的囊胚，囊胚完全從透明帶中脫出。3～6級囊胚需對內細胞（inner cell mass，ICM）和滋養(yǎng)外胚層細胞（trophectoderm，TE）進行評分。ICM評分：A級，細胞數(shù)目多，結合緊密；B級，細胞數(shù)目較少，結合較松散；C級，細胞數(shù)目極少。TE評分：A級，細胞數(shù)目多，囊胚四周均有細胞分布；B級，細胞數(shù)目較少，上皮細胞較松散；C級，細胞數(shù)目極少。將d5評分≥3AA、3AB、3BA、3BB或d6～7評分 ≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚定為優(yōu)質囊胚。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，率的比較采用χ2檢驗。

2 結果

本實驗共收集到782例患者的1 962個廢棄胚胎，經序貫培養(yǎng)，其中73例患者無可用卵裂期胚胎移植，685例患者行卵裂期胚胎移植。

2.1 不同來源的胚胎囊胚形成情況 根據(jù)胚胎受精情況，將廢棄胚胎分為0PN、1PN、2PN、≥3PN，比較不同來源的胚胎囊胚形成情況，來源1PN的胚胎囊胚形成率最高（P＜0.05），0PN次之，2PN及≥3PN最低，各組之間優(yōu)質囊胚率無統(tǒng)計學差異。詳見表2。

2.2 d3卵裂球數(shù)與囊胚形成情況 根據(jù)d3胚胎卵裂球數(shù)目將胚胎分為≤3，4～6，7～9，≥10幾組，≤3組的囊胚形成率（P＜0.05）最低，7～9組及≥10組囊胚形成率較高（均P＜0.05），但這兩組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。各組之間優(yōu)質胚胎率無統(tǒng)計學差異，詳見表3。

2.3 囊胚形成情況與妊娠率的關系 所有685例行卵裂期胚胎移植患者中，廢棄胚胎行囊胚培養(yǎng)有300例患者形成囊胚，臨床妊娠165例，妊娠率55.0%；385例患者未形成囊胚，臨床妊娠143例，妊娠率37.1%，兩組比較有統(tǒng)計學差異。73例患者中有9例由2PN胚胎形成10個囊胚并行囊胚移植，臨床妊娠6例，妊娠率66.7%。

2.4 剩余囊胚的處理 由2PN胚胎形成囊胚共64枚，其中10枚囊胚行移植，剩余囊胚行玻璃化冷凍保存。

2.5 解凍移植 2011—2013年，共26例患者進行凍融囊胚解凍移植，解凍囊胚39枚，獲得可移植囊胚35枚，移植周期24個，妊娠周期13個，臨床妊娠率54.2%。新鮮和凍融囊胚移植周期共獲得健康嬰兒18名。

表2 不同來源胚胎與囊胚形成的關系

表3 d3卵裂球數(shù)與囊胚形成的關系

3 討論

隨著輔助生殖技術的大量開展，由于促排卵藥物的應用產生多個卵子進行體外受精及培養(yǎng)，使得患者獲得多個可移植胚胎的同時會產生許多不適合移植胚胎，也稱為廢棄胚胎。廢棄胚胎主要包括異常受精胚胎、發(fā)育遲緩胚胎及胚胎評分差的胚胎。多數(shù)生殖中心對于廢棄胚胎多為丟棄。國外有報道利用IVF-ET后廢棄胚胎建立人類胚胎干細胞系[1]。楊華等[2]也報道利用IVF-ET后廢棄的評分較低的卵裂期胚胎序貫培養(yǎng)至囊胚階段并從中分離出一株人胚胎干細胞系。但是多數(shù)生殖中心并不存在培養(yǎng)胚胎干細胞的條件。

國內梁菊艷等[3]最早報道利用廢棄胚胎行囊胚培養(yǎng)。溫烯等[4]利用低質量人類胚胎行囊胚培養(yǎng)，囊胚形成率12.5%。我中心采用廢棄胚胎進行囊胚培養(yǎng)，方法簡單可靠，目的提高囊胚培養(yǎng)技術的同時，從廢棄胚胎中獲得了可用囊胚，提高了胚胎利用率。

在IVF-ET周期中，常有異常受精卵出現(xiàn)，形成0PN、1PN和≥3PN（以3PN為主）胚胎。3PN來源胚胎非整倍體發(fā)生率較高，染色體多體率高達70%～80%。0PN、1PN、2PN和3PN胚胎有不同程度的染色體異常發(fā)生率，序貫培養(yǎng)時，它們的囊胚形成情況存在差異。我們的結果顯示：1PN胚胎的囊胚形成率，0PN明顯高于3PN和2PN胚胎，這提示在廢棄胚胎中，0PN、1PN胚胎有較好的發(fā)育潛能。臨床上在無2PN正常受精胚胎移植的情況下，可選擇0PN胚胎和1PN胚胎移植，但需結合胚胎植入前遺傳學診斷以及產前診斷技術行染色體異常篩查。

胚胎生長速度對胚胎移植著床率、臨床妊娠率、活產率有明顯影響，對囊胚形成也有顯著影響。囊胚形成率與卵裂速度成正比，卵裂速度較快的胚胎更容易形成優(yōu)質囊胚。Neuber等[5]研究表明，d3卵裂球數(shù)目≥7個的優(yōu)質胚胎更容易發(fā)育成優(yōu)質囊胚。我們的研究也表明d3細胞數(shù)＞6的兩組顯著高于≤6的兩組。

同時，胚胎碎片情況也與囊胚形成密切相關。Hardy等[6]研究表明，隨著胚胎碎片的增多，囊胚形成率降低，當碎片＞25%時，很少有胚胎能發(fā)育到囊胚階段；碎片＜10%時不會影響囊胚的形成，但是碎片＞15%,囊胚的形成率顯著下降。我們培養(yǎng)過程中2PN胚胎形成囊胚情況明顯降低，可能原因為廢棄的2PN胚胎主要為碎片較多的Ⅳ級，影響了囊胚的形成。

在IVF-ET治療過程中有部分患者因為胚胎質量差而放棄移植，但是我們的實驗表明仍有部分Ⅳ級胚胎可以形成囊胚。囊胚是胚胎發(fā)育的重要階段，研究表明囊胚移植使胚胎發(fā)育和子宮內膜的生理階段同步化，提高了胚胎著床率的同時提高了臨床妊娠率。我們對部分無可用胚胎的患者進行廢棄胚胎囊胚培養(yǎng)移植，并獲得妊娠（妊娠率66.7%）。同時，通過廢棄胚胎的囊胚培養(yǎng)，獲得了部分可以利用的囊胚并進行了玻璃化冷凍，提高了胚胎利用率。

由于胚胎植入前遺傳學診斷技術的限制，為了降低成本及保證胚胎移植的安全性，我們在實際臨床工作中應主要選擇受精情況正常（2PN），d3碎片較多、評分較低的胚胎行囊胚培養(yǎng)，這樣獲得的囊胚才可以應用于臨床中。同時由于囊胚移植多為單胚胎移植，顯著降低臨床多胎率。本文由于數(shù)據(jù)不多，并未進行相關統(tǒng)計。

同時，我中心對由2PN胚胎培養(yǎng)獲得的凍融囊胚行凍融囊胚移植，獲得滿意的臨床妊娠率（54.2%）。我們隨訪了囊胚移植獲得的嬰兒未發(fā)現(xiàn)畸形等情況。目前，對胚胎質量評估的方法中，應用最廣泛的是對配子、胚胎各時期的形態(tài)特征進行評分的形態(tài)學評價法。我們的結果提示按照該方法行胚胎評價的廢棄胚胎行囊胚培養(yǎng)后移植對子代并無不利的影響。本文由于數(shù)據(jù)不多，并未進行相關統(tǒng)計。

臨床上的廢棄胚胎有不同程度的發(fā)育潛能，若能選擇合適的胚胎進行囊胚培養(yǎng)，可以提高胚胎利用率，使得部分無可用胚胎患者獲得移植及妊娠的可能，同時移植剩余胚胎囊胚的形成對妊娠具有一定的預測意義。

[1]Lerou P H,Yabuuchi A,Huo H,et al.Derivation and maintenance of human embryonic stem cells from poor-quality in vitro fertilization embryos[J].Nat Protoc,2008,3(5):923-933.

[2]楊華,丘映,劉鋒,等.應用卵裂期廢棄胚胎培養(yǎng)建立人胚胎干細胞系的方法探索[J].廣西醫(yī)科大學學報,2011,28(1):31-35.

[3]梁菊艷,王芳,孫瑩璞,等.廢棄胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)研究[J].生殖與避孕,2008,28(10):598-601.

[4]溫烯,李蓉,郝桂琴,等.低質量人類胚胎體外發(fā)育至囊胚能力的研究[J].現(xiàn)代婦產科進展,2010,19(4):286-288．

[5]Neuber E,Rinaudo P,Trimarchi J R,et al.Sequential assessment findividually cultured human embryos as an indicator of subsequent good quality lastocyst development[J].Hum Reprod,2003,18 (6):1307-1312.

[6]Hardy K,Stark J,Winston R M.Maintenance of the inner cell mass in human blastocysts from fragmented embryos[J].Biol Reprod, 2003,68(4):1165-1169.

Potential use of discarded embryos for in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET)

Objective To explore the potential use of discarded embryos for in vitro fertilization-embryo transfer(IVF-ET).MethodsThe discarded embryos from d3 were cultured into blastula by the sequential culture method.ResultsA total of 1962 discarded embryos from 782 patients were cultured,in which 376 blastocysts were formed with a blastocyst rate of 19.2%.The blastocyst formation rates were significantly higher from 1PN,0PN and＞6 cells embryos.The clinical pregnancy rate in women with blastosphere formed was significantly higher than those without blastosphere formed.Sixty four blastocysts were formed for 2PN,10 of which were transferred while the others were frozen.The clinical pregnancy rate of blastocyst transfer was 66.7%.Thirteen women got pregnant in 24 frozen-thawed blastocyst transfer cycles.A total of 18 healthy babies were born from blastocyst transfer.ConclusionThe discarded embryos have different development potential．They can develop into biastospheres.Blastocyst from appropriate discarded embryos can improve the utilization rate of embryos.

IVF-ET Discarded embryos BlastocystSequential culture

2013-03-29）

（本文編輯：沈昱平）

金華市科技局科技項目（2007-3-043）

321000 金華市人民醫(yī)院生殖中心

IVF-ET中廢棄胚胎部分可發(fā)育為囊胚，選擇合適的胚胎行囊胚培養(yǎng)，能獲得部分可用胚胎，提高胚胎利用率。