王 晶

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院， 遼寧 錦州 121000）

秦皮甲素對(duì)肺癌小鼠抑瘤作用的研究

王 晶

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院， 遼寧 錦州 121000）

目的 探討秦皮甲素對(duì)小鼠肺癌移植瘤的影響及作用機(jī)制。 方法 分組對(duì)比觀察秦皮甲素對(duì)小鼠 Lewis肺癌移植瘤的影響， 瘤組織稱重計(jì)算抑瘤率， 免疫印跡法檢測(cè)秦皮甲素對(duì)凋亡基因 Bax、 Bcl-2 的影響。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)瘤細(xì)胞增殖周期及凋亡， JC-1 染色檢測(cè)線粒體膜電位。 結(jié)果 秦皮甲素可抑制小鼠肺癌移植瘤的生長(zhǎng)和瘤細(xì)胞的增殖周期， 降低線粒體膜電位， 在上調(diào) Bax蛋白表達(dá)的同時(shí)下調(diào) Bcl-2 蛋白表達(dá)， 且呈劑量依賴性。 結(jié)論 秦皮甲素對(duì)小鼠肺癌移植瘤有顯著的抑制作用。使腫瘤細(xì)胞阻滯于S期，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡。

秦皮甲素；肺癌；線粒體途徑

秦皮甲素是中藥秦皮中的主要成分，在秦皮中含有量高 (1.436% ～3.043%)。 秦皮甲素是秦皮發(fā)揮藥理作用最重要的成分，對(duì)機(jī)體各系統(tǒng)作用廣泛，具有抗腫瘤、抗微生物、抗氧化與消除自由基等作用［1］。 在前期我們研究了秦皮甲素對(duì)肺癌細(xì)胞 H125 的影響， 發(fā)現(xiàn)秦皮甲素可抑制肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡［2］。 但是， 秦皮甲素在體內(nèi)對(duì)肺癌移植瘤模型是否發(fā)揮作用，對(duì)腫瘤相關(guān)癌基因與抑癌基因的表達(dá)是否有影響等方面還需要進(jìn)一步探討。因此，我們需要利用現(xiàn)代藥學(xué)研究手段，對(duì)秦皮甲素抗肺癌作用進(jìn)行研究，掌握其作用機(jī)制，以更好地利用我國(guó)獨(dú)特的中藥資源優(yōu)勢(shì)，為臨床服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物及瘤株 C57BL/6 j小鼠， 雄性， 6 ～8周齡， 20 ～22 g。 購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

Lewis肺癌細(xì)胞株， 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物 秦皮甲素， 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定 所， 批 號(hào) 200104。順 鉑， 批 號(hào) 20120902 (江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)。 兔抗人 Bax抗體 (SANTA CRUZ公司， 型號(hào) SC—526)。 兔抗人 Bcl-2 抗 體 (SANTA CRUZ公 司， 型 號(hào) 為 SC-429)。

1.3 試 劑 線 粒 體 膜 電 位 檢 測(cè) 試 劑 盒 (JC-1) (碧云天生物技術(shù)研究所)； 線粒體提取試劑盒(南京建成生物工程研究所)； 胰蛋白酶 (Hyclone公司)； 小牛血清 (杭州四季青生物制品公司)；DMEM培 養(yǎng) 基 干 粉 (GIBCO 公 司 ) ； Annexin VFITC凋亡試劑盒 (北京寶賽生物公司)； 碘化丙啶(Amresco公司)； 細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒 (南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.4 儀器 流式細(xì)胞儀 (BD FACSCaLibur)； 超凈工作臺(tái) (江蘇吳縣市凈化技術(shù)研究所)； 二氧化碳 培 養(yǎng) 箱 (Sheldon Manufacturing IncUSA)； KA-1000C型飛鴿離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)；CX21 型雙目生物 顯 微 鏡 ( 日本 Olympus公 司)；WD-9413B型凝膠成像分析儀 (上海圣科儀器設(shè)備有限公司)； DYY-7C型電泳儀 ( 北京六一儀器廠)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型的建立 Lewis細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇， 傳代， 用含 10% 小牛血清 的 培 養(yǎng) 基， 在 5%CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。 0.25%胰蛋白酶消化傳代， 待細(xì)胞長(zhǎng)至 80%融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞密度為 2 ×108個(gè)/mL。將制備好的單細(xì)胞懸液接種于小鼠右腋皮下，每只0.2 mL。模型復(fù)制成功后，隨機(jī)分為 5 組，每組15 只， 即陰性對(duì)照組 (生理鹽水 0.2 mL)； 陽性對(duì)照組 (順鉑 100 mg/kg)； 秦皮甲素高、 中、 低劑量組 (400、 200、100 mg/kg)。用藥后第 20 天處死全部小鼠， 進(jìn)行指標(biāo)觀察［3-5］。

2.2 抑瘤率 取各組瘤組織稱定質(zhì)量， 計(jì)算抑瘤率。 抑瘤率 (%)=(1-治療組平均瘤重/生理鹽水組平均瘤重) ×100%

2.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 取少許瘤組織， 用生理鹽水研磨， 4 ℃預(yù)冷， 70%乙醇固定， 檢測(cè)前離心棄去固定液， PBS液重懸， 然后按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒的要求進(jìn)行操作。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期［4］。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取少量瘤組織， 用生理鹽水研 磨， 采 用 Annexin V-FITC 染 色， 加 入10μLAnnexinV-FITC和 5 μLPI， 輕輕混勻， 室溫避光反應(yīng) 10 ～15 min 后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。 所得數(shù) 據(jù) 經(jīng) Bioconsort專 用 軟 件處理， 分析 細(xì) 胞 凋亡率［5］。

2.5 JC-1 染色檢測(cè)線粒體膜電位 稱取 200 mg瘤組織， PBS 沖洗， 制備細(xì)胞勻漿。4 ℃ 800 ×g離心 5 min。 在另 一 個(gè) 新 的 預(yù) 冷 的 離 心 管中 加 入0.5 mL Medium Buffer， 將勻漿后的上清液沿管壁小心加入該離心管中， 4 ℃ 15 000 ×g離心 10min，上清轉(zhuǎn)移至新離心管。重懸線粒體沉淀，4℃15 000 ×g離心 10 min， 棄 上 清。 用 50 mL Store Buffer重懸線粒體沉淀。 然后按線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒的說明書操作。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果用綠色熒光細(xì)胞百分率表示。

2.6 免疫印跡法檢測(cè) Bax、 Bcl-2 蛋白的表達(dá) 將存于 -80 ℃冰箱中的組織解凍加入裂解液， 于4 ℃下裂解 30 min， 4 ℃高速離心后取上清液并測(cè)定蛋白含有量， 加入上樣緩沖液混勻， -20 ℃冰箱中保存。應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)， 半干法轉(zhuǎn)膜。 加入一抗， 4 ℃過夜， 洗膜。加入二抗，室溫下在搖床上雜交 1 h，洗膜3次。顯色，結(jié)果應(yīng)用生物凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描照相［6］。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以表示。 進(jìn)行 t檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 秦皮甲素對(duì)小鼠移植瘤的抑制作用 秦皮甲素治療后，秦皮甲素組和順鉑組瘤重較陰性對(duì)照組明顯減輕 (P＜0.05)， 結(jié)果見表1。 因秦皮甲素中劑量組和順鉑組的抑瘤率無明顯差異。因此在以后的檢測(cè)試驗(yàn)中，我們僅選用秦皮甲素中劑量組與順鉑組進(jìn)行比較。

3.2 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠腫瘤細(xì)胞周期的影響 各組小鼠腫瘤細(xì)胞周期各時(shí)相的分布數(shù)據(jù)見表2。結(jié)果表明，順鉑組和秦皮甲素組均可以使瘤細(xì)胞G2/M期的比例減少， S 期的比例增加。與陰性對(duì)照組比較， 差異顯著 (P＜0.05)。

3.3 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 由表3可見，秦皮甲素組與順鉑組均可誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡，與生理鹽水組比較差異顯著 (P＜0.05)。

表 1 秦皮甲素對(duì)小鼠移植瘤的抑制作用 （ n=15，）Tab.1 Inhibition effects of aesculin on Lew is lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

表 1 秦皮甲素對(duì)小鼠移植瘤的抑制作用 （ n=15，）Tab.1 Inhibition effects of aesculin on Lew is lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

注: 與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組 別劑量 /(mg·kg-1·d-1)動(dòng)物數(shù) /只瘤重指數(shù)抑瘤率 /%生理鹽水組-151.310 2 ±0.102 4-順鉑組100150.581 7 ±0.001 355.6%**秦皮甲素低劑量組100150.741 5 ±0.015 843.41%**秦皮甲素中劑量組200150.601 3 ±0.017 254.1%**秦皮甲素高劑量組400150.478 2 ±0.005 163.5%**

表2 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠腫瘤細(xì)胞周期的影響（n=15，）Tab.2 Effects of aesculin on cell cycle of Lew is lung cancer xenografts inm ice（n=15，）

表2 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠腫瘤細(xì)胞周期的影響（n=15，）Tab.2 Effects of aesculin on cell cycle of Lew is lung cancer xenografts inm ice（n=15，）

注: 與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別G0/G1SG2/M生理鹽水組35.930 ±0.035.850 ±0.0235.210 ±0.04順鉑組32.390 ±0.079.970 ±0.05*27.150 ±0.09*秦皮甲素組30.238 ±0.239.820 ±0.05*26.090 ±0.15*

表3 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響（n=15，）Tab.3 Effects of aesculin on cell apoptosis of Lewis lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

表3 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響（n=15，）Tab.3 Effects of aesculin on cell apoptosis of Lewis lung cancer xenografts in m ice（ n =15，）

注: 與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別凋亡率/%生理鹽水組0.08 ±0.017順鉑組12.310 ±0.095**秦皮甲素組13.529 ±0.054**

3.4 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠線粒體膜電位的影響 JC-1 熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位， 結(jié)果顯示，順鉑組與秦皮甲素組均可降低線粒體膜電位。結(jié)果見表 4， 圖 1。

表4 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠線粒體膜電位的影響（n=15，）Tab.4 Effects of aesculin on m itochondrialmembrane potential of Lewis lung cancer xenografts in m ice（n=15，）

表4 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠線粒體膜電位的影響（n=15，）Tab.4 Effects of aesculin on m itochondrialmembrane potential of Lewis lung cancer xenografts in m ice（n=15，）

注: 與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別綠色熒光細(xì)胞百分率/%生理鹽水組1.35 ±0.24順鉑組21.04 ±0.47**秦皮甲素組19.27 ±0.39**

3.5 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠 Bax、 Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響 由圖2可知，順鉑組和秦皮甲素組與生理鹽水組比較，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)而 Bcl-2 蛋白表達(dá)受到抑制。

圖 1 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠線粒體膜電位的影響 （n=15）Fig.1 Effects of aesculin onm itochondrialmembrane potential of Lewis lung cancer xenografts in m ice（ n=15）

4 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，治療腫瘤最有效的途徑是直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)、新思路［7］。 中藥誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡是一個(gè)新興的課題，隨著其研究的不斷深入，對(duì)于揭示中藥的作用機(jī)制，篩選抗腫瘤新藥，均具有十分重要的意義［8］。

秦皮是常用中藥，秦皮甲素是中藥秦皮中的主要有效成分。通過體內(nèi)試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，秦皮甲素可以抑制小鼠肺癌移植瘤的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴性。

圖 2 秦皮甲素對(duì)肺癌移植瘤小鼠 Bax、 Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of aescu lin on Bax and Bcl-2 p rotein of Lewis lung cancer xenografts in m ice

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與凋亡異常密不可分，所以研究能夠促進(jìn)凋亡的抗癌藥物是目前腫瘤治療的主要手段之一。已知兩種信號(hào)途徑可以誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，即死亡受體途徑和線粒體途徑。在線粒體途徑中，線粒體膜電位降低是細(xì)胞凋亡的早期特征，通過體內(nèi)試驗(yàn)，我們看到秦皮甲素可以使瘤組織的線粒體膜電位下降而誘導(dǎo)凋亡。線粒體在細(xì)胞凋亡中的重要性還在于它與 Bcl-2 基因家族的關(guān)系。 Bcl-2家族在線粒體途徑中起著重要的調(diào)控作用，它分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。通過檢測(cè)凋亡基因，我們發(fā)現(xiàn)秦皮甲素可以促進(jìn)促凋亡蛋白 Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達(dá)， 這進(jìn)一步證實(shí)線粒體途徑是秦皮甲素誘導(dǎo)凋亡的重要機(jī)制［9-11］。

在細(xì)胞周期中， 最重要的調(diào)控點(diǎn)是 G1/S 調(diào)控點(diǎn)，細(xì)胞在該點(diǎn)分析細(xì)胞內(nèi)外的各種復(fù)雜信號(hào)以及DNA損傷情況， 以決定細(xì)胞是進(jìn)入分裂程序 S期，還是處于靜止的 G0期。 通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)， 表明秦皮甲素可將肺癌移植瘤小鼠腫瘤細(xì)胞周期阻滯于 S 期， 使其不能進(jìn)入 G2/M期， 即不能正常進(jìn)行細(xì)胞周期活動(dòng)［12-15］。

綜上所述，秦皮甲素可抑制小鼠肺癌移植瘤的生長(zhǎng)，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡。但秦皮甲素在體內(nèi)外對(duì)肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移、黏附等方面是否有影響尚有待進(jìn)一步深入研究。此外，秦皮甲素通過影響哪些通路、受體而發(fā)揮抗肺癌作用等均需要在以后的實(shí)驗(yàn)中深入探討。

［ 1 ］ 方蓮花， 呂 揚(yáng)， 杜冠華.秦皮的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志， 2008， 33(23):2733-2735.

［ 2 ］ 王 晶.秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞 H125 體外增殖的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2011， 22(2):507-509.

［3］ 彭 鵬，宋玉華，邱少敏，等.三氧化二砷對(duì)小鼠肺癌移植瘤治療作用的研究［ J］.中華臨床中醫(yī)雜志， 2012， 6 (10):198-199.

［ 4 ］ 張 波， 柴 智.蟲類攻毒法、 草木解毒法對(duì)小鼠 Lewis肺癌移植瘤的抑制作用及其機(jī)制的研究［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2011， 6(3):203-205.

［5］ 王 晶，王洪新，李紅玉，等.秦皮乙素的制備及對(duì)人肝癌細(xì)胞 SMMC-7721 體外增殖的影響［ J］ .中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 2009， 26(16):439-442.

［ 6 ］ 王麗紅， 偉忠民.秦皮乙素對(duì)小鼠皮下 Hepal-6 肝癌移植瘤凋亡基因 Bcl-2、 Bax表達(dá)的影響［ J］ .中國(guó)藥房， 2012，23(15):1356-1358.

［7］ 劉 巖，張 虹，金 雪，等.荷包牡丹堿誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞 A549 凋亡及其機(jī)制初探［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志， 2011，46(24):1890-1893.

［ 8 ］ 萬 茜， 章永紅.中藥誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展［J］.河北中醫(yī)， 2009， 31(4):628-630.

［ 9 ］ 梁靚靚， 陳蘇寧， 蔡玉文.調(diào)氣消積湯對(duì) Lewis肺癌移植瘤血管生成影響的實(shí)驗(yàn)研究［ J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技， 2011，18(4):284-286.

［10］ 遲淑萍， 高 蓉， 汪 辰， 等.海螵蛸衍生物 SC002 抗腫瘤相關(guān)分子機(jī)制的研究［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011， 27(2):212-214.

［11］ 林 箐， 彭華毅.黃葵素誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤 B16 細(xì)胞凋亡的研 究 ［ J］. 中 國(guó) 藥 理 學(xué) 通 報(bào)， 2010， 26(12): 1630-1634.

［12］ 宋少華， 郭聞淵， 傅志仁， 等.丹參多酚酸鹽通過線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞的凋亡［ J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志， 2010， 17(1):62-66.

［13］ 曲 佳， 郭坤元， 吳秉毅， 等.冬凌草甲素誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤 ARH-77 凋亡及其可能機(jī)制［ J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志， 2010， 17(2):134-138.

［14］ 賈永清， 滕 熔， 胡慧仙.亞硒酸鈉對(duì) HL-60 細(xì)胞增殖、凋亡影響及作用機(jī)制探討［J］.交通醫(yī)學(xué)， 2011， 25(2): 121-125.

［15］ 顧 后.中藥對(duì)肺癌細(xì)胞增殖與凋亡影響的研究進(jìn)展［ J］.云南中醫(yī)中藥雜志， 2007， 28(5):42-44.

Inhibitory effect of aesculin on m ice w ith Lew is lung cancer

WANG Jing

(First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University， Jinzhou， 121000， China)

AIM To explore the effect and mechanism of aesculin onmouse xenotransplanted Lewis lung cancer.METHODS Mouse Lewis lung cancer xenograft model was used to study the effect of aesculin on tumor growth.The tumor tissue was weighted to calculate the antitumor rate.Influence of aesculin on apoptotic genes Bax， Bcl-2 was determined byWestern blot.Distribution of tumor cell cycle and apoptotic cell death were analyzed by flow cytometry and mitochondrialmembrane potential JC-1 staining.RESULTS Aesculin inhibitedmouse lung tumor growth and tumor cell proliferation cycle and reduced the mitochondrialmembrane potential.Aesculin promoted Bax protein expression and at the same time lowered Bcl-2 protein expression in a dose dependentmanner. CONCLUSION Aesculin has a significant inhibition against the growth of mouse xenotransplanted Leise lung cancer， whose cycles are arrested at S phase.Aesculin could induce apoptosis through themitochondrial pathway.

Aesculin； Lewis lung cancer； mitochondrial pathway

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0249-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.007

2013-03-11

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (2013022063)

王 晶 (1974—) ， 女， 主管藥師， 研究方向: 中藥抗腫瘤藥理。 Tel:15004162307， Email:wangjing2006050@126.com