包永睿， 王 帥， 孟憲生*， 鞏曉杰， 楊欣欣

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 116600； 2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連116600； 3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116600）

薏苡仁脂肪酸類成分對(duì)人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響

包永睿1，2，3， 王 帥1，2，3， 孟憲生1，2，3*， 鞏曉杰1， 楊欣欣1，2，3

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 116600； 2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連116600； 3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116600）

目的 研究薏苡仁脂肪酸類成分對(duì)人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721 增值的影響及作用機(jī)制初探。 方法 采用 MTT法考察不同給藥劑量， 不同給藥時(shí)間下薏苡仁脂肪酸類成分對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞的增值抑制作用及其與時(shí)間、 劑量的關(guān)系； 碘化丙啶 PI單染色法檢測(cè)薏苡仁脂肪酸作用后， SMMC-7721 細(xì)胞周期 DNA水平變化； Annexin V-EGFP/PI雙染法研究薏苡仁脂肪酸對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞凋亡 率的影響。 結(jié)果 不 同質(zhì)量濃度 的薏苡 仁脂肪 酸 作用 SMMC-7721 細(xì)胞24、 48、 72 h 后， 均呈現(xiàn)出較好的細(xì)胞增殖抑制作用， 且具有明顯的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)； 不同質(zhì)量濃度的薏苡仁脂肪酸處理 SMMC-7721 細(xì)胞 22 h 后可顯著增加肝癌細(xì)胞凋亡率， (P＜0.001)； 作用36 h 后， 可顯著降低 G2/M期細(xì)胞比例， (P＜0.001)。 結(jié)論 薏苡仁脂肪酸對(duì)人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞具有明顯的抑制作用并可誘導(dǎo)其凋亡， 其作用是通過抑制 G2/M細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。

薏苡仁脂肪酸類； 人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞株； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡

薏苡仁為 禾 本 科植物薏苡 Coix lacryma-jobi L. var.mayuen(Roman.)Stapf的干 燥 成 熟種仁， 味甘、淡，性涼；歸脾、胃、肺經(jīng)；具有利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結(jié)的功效，用于水腫、腳氣、小便不利、脾虛泄瀉、濕痹拘攣、肺癰、腸癰、 癌腫等［1］。 薏苡仁中含有多種活性成分，主要包括薏苡仁酯、甘油三酯類、脂肪酸類、內(nèi)酰胺類、薏苡內(nèi)酯、 糖類、 甾醇類、 三萜類等化合物［2-5］。

根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，發(fā)現(xiàn)薏苡仁脂肪酸類成分的抗腫瘤活性報(bào)道較多，但其抗肝臟等惡性腫瘤作用機(jī)制研究較少。本實(shí)驗(yàn)是在前期薏苡仁脂肪酸類成分富集、 解析研究工作 基礎(chǔ)上［6-7］， 即藥 效物質(zhì)成分構(gòu)成基本明確的基礎(chǔ)上， 采用 MTT法對(duì)薏苡仁脂肪酸類成分進(jìn)行體外抗肝臟腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)富集到的薏苡仁脂肪酸類成分具有明顯的抑制腫瘤活性。在此研究基礎(chǔ)上， 進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀 PI染色法和 Annexin V-EGFP/PI雙染法研究薏苡仁脂肪酸類成分對(duì)人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響， 探討其對(duì) SMMC-7721 腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，為今后開展治療原發(fā)性肝癌創(chuàng)新藥物的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞 (上海復(fù)蒙生物有限公司， 培養(yǎng)于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中)。

1.2 主要藥材 薏苡仁脂肪酸類成分 (遼寧中醫(yī)藥大 學(xué) 分 析 測(cè) 試 中 心 自 制［6］)； 環(huán) 磷 酰 胺 片(CTX)(南通精華制藥有限公司)； 胎牛血清 (美國(guó) Hyclone公司)； 細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (碧云天生物技術(shù)有限公司)； Annexin V/PI雙染色試劑盒 (南京凱基生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基與胰蛋白酶 (美國(guó) Gibco公司)； 超純水 ( 由 Milli-Q純水系統(tǒng)制得)［8-9］。

1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀 (美國(guó) BD公司)；CO2培養(yǎng)箱 ( 德國(guó) NuAire公司)；酶 標(biāo)儀 ( 瑞士Tecan 公司)； 電子天平 (德國(guó)賽多利斯集團(tuán))； 倒置相差顯微鏡 (德國(guó)麥克奧迪公司)。

2 方法

2.1 薏苡仁脂肪酸類成分體外藥效學(xué)檢測(cè)［8-9］

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞復(fù)蘇后， 按貼 壁 細(xì)胞培養(yǎng)法， 以 細(xì) 胞 計(jì) 數(shù) 5 ×105個(gè)/m L培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中，每?jī)商靷鞔淮?，取?duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 培養(yǎng)條件為 37 ℃、 5%CO2、飽和濕度。

2.1.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) (MTT法) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期 的 細(xì) 胞， 0.25% 胰 酶 消 化 后， 以 5 ×104(個(gè)/mL)細(xì)胞數(shù)接種于 96 孔培養(yǎng)板。 分別設(shè)試驗(yàn)組、空白對(duì)照組和空白調(diào)零組 (只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞)。 培養(yǎng) 24、 48、72 h 后， 每孔加入 5 mg/mL MTT溶液20 μL， 4 h 后吸棄上清液， 加入 150 μL DMSO， 震蕩溶解紫色結(jié)晶， 酶標(biāo)儀 492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度 (OD)； 計(jì)算細(xì)胞增值抑制率［8，10-12］。

2.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 S PSS 16.0 軟件單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，結(jié)果用表示， P＜0.05 為有顯著性差異，同時(shí)計(jì)算 I C50值。

2.2 薏苡仁脂肪酸類成分對(duì) S MMC-7721 細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響

2.2.1 藥物制備與分組 精密量取薏苡仁脂肪酸類成分 1 mL， 加 0 .5%CMC-Na 5 μL， 用培養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度為 6 2.5 μL/mL的貯備液作為高劑量組；再按比例稀釋成質(zhì)量濃度為 1 5.63 μL/mL的溶液作為低劑量組， 0.22 μm微孔濾膜過濾， 備用。

2.2.2 細(xì)胞周期的檢測(cè) (碘化丙啶 P I單染法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞計(jì)數(shù)為1× 107個(gè)/瓶， 分別加入 6 2.5 μL/m L， 15.63 μL/mL薏苡仁藥液， 空白對(duì)照組加入含 0 .5%CMC-Na的等體積培養(yǎng)液，36 h 后收集細(xì)胞。 用冷 P BS 液洗滌細(xì)胞2 次后， 加入預(yù)冷的 7 0%乙醇 4 ℃下固定12 h， 再用 P BS 液洗滌細(xì)胞1 次。 每組細(xì)胞樣品中加入0.5 mL PI染色液， 混懸， 37 ℃避光溫浴 3 0 min， 流式細(xì)胞儀 4 88 nm處檢測(cè)， ModFit細(xì)胞周期擬和軟件分析［8-9，13-15］。

2.3 薏苡仁脂肪酸類成分對(duì) S MMC-7721 細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 藥物制備與分組 精密量取薏苡仁脂肪酸類成分 1 mL， 加 0 .5%CMC-Na 5 μL， 用培養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度為 31.25 μL/mL的貯備液作為高劑量組； 再 按 比 例 稀 釋 成 質(zhì) 量 濃 度 為 15.63、 7.81 μL/mL的溶液作為中、 低劑量組， 0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) (Annexin V-EGFP/PI雙染色法) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)為 1 ×105個(gè)/孔， 24 h 后，每孔加入 1 mL不同組別藥物，對(duì)照組1加入等體積培養(yǎng)液，對(duì)照組2加入等體積 0.5%DMSO水溶液， 分別培養(yǎng) 22、 46 h后， 收集細(xì)胞， 用冷 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次后， 加入Binding Buffer 500 μL， 懸浮細(xì)胞， 然后再分別加入5 μL的 AnnexinV-EGFP和 Propidium Iodide， 混勻，室溫避光反應(yīng) 5 ～15 min， 在 1h 內(nèi)， 用流式細(xì)胞儀Cell Quest軟件分析細(xì)胞凋亡情況［8-9，16-18］。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS16.0 軟件進(jìn)行 t檢驗(yàn)分析，結(jié)果用表示；P＜0.05，0.01， 0.001表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 薏苡仁脂肪酸類成分對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞株的增殖抑制作用 6.25 ～200 μL/mL薏苡仁脂肪酸類成分， 作用 SMMC-7721 細(xì)胞 24、 48、 72 h 后， 對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果見表1。

表 1 薏苡仁脂肪酸類成分對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞株生長(zhǎng)曲線的影響 （n=6）Tab.1 Fatty acid com position from coicis semen im pacting the grow th curve line of human hepatoma SMMC-7721 cell（n=6）

由表 1 可知， 薏苡仁脂肪酸類成分對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞抑制作用顯著， 隨著藥物質(zhì)量濃度與作用時(shí)間的增加與延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率逐漸增加，表現(xiàn)出了較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系， 不同給藥時(shí)間下均在給藥劑量為 100 μL/m L時(shí)效果最好。 從給藥時(shí)間上看， 給藥 72 h 各組表現(xiàn)出較好的抑制率， IC50隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，說明薏苡仁脂肪酸類成分體外起效具有一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

3.2 薏苡仁脂肪酸類成分對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響 由表 2、 圖 1 可知，在 G0/G1期，給藥組與空白組比較 DNA水平均有所增加， 高、低劑量組較空白組均有顯著性差異 (P＜0.01)； S期， 給藥組與空白組比較， 含有量差異不大； G2/ M期， 給藥組與空白組比較 DNA水平明顯降低，高、低劑量組較空白組均有顯著性差異 (P＜0.001)。 說明薏苡仁提取物能造成 SMMC-7721 細(xì)胞 G2/M期阻滯， 從而影響細(xì)胞周期正常進(jìn)行。

表2 薏苡仁脂肪酸類成分作用于細(xì)胞后細(xì)胞周期 DNA水平變化Tab.2 Fatty acid composition from coicis semen changing content of DNA in the after cell cycle

3.3 薏苡仁脂肪酸類成分對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響 由圖2、 表3可知， 當(dāng)藥物作用細(xì)胞22、 46 h 后， 3 個(gè)給藥組與對(duì)照組比較， 早期凋亡比例與凋亡總比例均有顯著差異；另外，藥物作用 46h 后的細(xì)胞， 晚期凋亡比例也出現(xiàn)了顯著差異。隨著藥物濃度與作用時(shí)間的增高和延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率也隨之增大。表明薏苡仁脂肪酸類成分促進(jìn)SMMC-772 l細(xì)胞凋亡作用明顯， 尤其是作用 22h 后的早期凋亡，說明薏苡仁脂肪酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要作用在早期。

4 討論

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。全球發(fā)病率逐年增長(zhǎng)， 已超過 62.6 萬/年， 據(jù)統(tǒng)計(jì)， 每年因肝癌死亡人數(shù)接近60萬人， 居于惡性腫瘤的第五位。目前我國(guó)發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康和生命的一大殺手［19-20］。

圖1 薏苡仁脂肪酸類成分細(xì)胞周期分布圖Fig.1 Cell cycle distribu tion icon of fatty acid com position from coicis semen

圖 2 Annexin V-EGFP/PI雙染檢測(cè)薏苡仁脂肪酸類成分誘 導(dǎo) SMMC-7721 細(xì)胞凋亡Fig.2 Detecting SMMC-7721 apoptosis induced by the fatty acid com position from coicis semen through the method of Annexin V-EGFP/PI double staining

表3 不同時(shí)間不同劑量薏苡仁脂肪酸類成分對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響Tab.3 Effect on rate of apoptosis of different doses of from soisis semen fatty acid in different times

本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)薏苡仁脂肪酸類成分開展了分離富集、成分分析研究，得到的薏苡仁脂肪酸類成分主要由三亞油酸甘油酯、二亞油酸甘油酯、棕櫚酸二亞油酸甘油酯、亞油酸二油酸甘油酯、棕櫚酸亞油酸油酸甘油酯、二棕櫚酸亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯、棕櫚酸二油酸甘油酯、二棕櫚酸油酸甘油酯、 二油酸硬脂酸甘油酯等成分組成［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)， 該成分對(duì)人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞株具有明顯的增殖抑制作用。進(jìn)一步的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明，薏苡仁脂肪酸類成分可誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞凋亡， 且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，晚期凋亡比例逐漸上升，這種誘導(dǎo)效應(yīng)呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。 薏苡仁脂肪酸類成分對(duì)細(xì)胞周期的作用是通過抑制 G2/M細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)研究說明薏苡仁脂肪酸類組分對(duì)人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞的作用機(jī)制是通過誘導(dǎo) SMMC-7721 細(xì)胞早期凋亡， 抑制 G2/M細(xì)胞周期， 從而達(dá)到治療肝腫瘤的作用，該研究為研制抗肝癌現(xiàn)代新藥提供方向。

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Effect of Semen coicis fatty acid on cell cycle and apoptosis induction of human hepatom a cell line SMMC-7721

BAO Yong-rui1，2，3， WANG Shuai1，2，3， MENG Xian-sheng1，2，3*， GONG Xiao-jie1， YANG Xin-xin1，2，3
(1.College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China； 2.Liaoning Provincial Multi-component Chinese Medicine Engineering Technology Research Center， Dalian 116600， China； 3.Liaoning Provincial Modern Traditional ChineseMedicine Research and Engineering Laboratory， Dalian 116600， China)

AIM To investigate the inhibitory effect of fatty acid from coicis semen on human hepatoma cell line SMMC-7721.METHOD MTTmethod was used to evaluate the inhibitory rate and time-doses relationship of fatty acid on SMMC-7721 with different doses and delivery times.Flow cytometry PI stainingmethod was used to measure the changes of DNA content and Annexin V-EGFP/PI double staining method was used for the apoptotic rate in SMMC-7721.RESULTS Experiment data showed significant cell proliferous inhibition with obvious timedose-effect relationship with significant difference(P＜0.05)， after 24， 48，72 h of incabation of SMMC-7721 with different concentrations of fatty acid from coicis semen.Incubation of SMMC-7721 with different concentrationsof fatty acid from coicis semen for 22 h and 36 h significantly increased the liver cell apoptostic rate， (P＜0.001) ， and reduced the G2/M phase cell proportion with statisticalmeanings(P＜0.001) ， respectively.CONCLUSION The fatty acid from coicis semen can inhibit the hepatoma cell line SMMC-7721 in vitro by inhibiting cell proliferation and inducing cell apoptosis by inhibiting G2/M phase cell proportion.

fatty acid from coicis semen； Human hepatoma SMMC-7721cell line； cell cycle； cell apoptosis

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0235-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.004

2013-02-20

國(guó)家 “ 重大新藥創(chuàng)制” 科技重大專項(xiàng) (2010ZX09401-304-105C)

包永 睿 (1978—) ， 男， 碩 士， 主 要 從 事 中 藥 質(zhì) 量 分 析 及 作 用 機(jī) 制 研 究 工 作。 Tel:(0411)87406496， E-mail:byr1026 @163.com

*通信作者: 孟憲生 (1964—)， 男， 教授， 博 士， 主要 從事 從事中 藥組 分配伍、 代謝 組學(xué) 及藥品 質(zhì)量 分析工 作。 Tel:(0411) 87406496， Email:mxsvvv@126.com