徐 坤， 舒 展， 王永林， 許瓊明， 楊世林， 劉艷麗*

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院， 江蘇 蘇州 215123； 2.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550004）

白頭翁皂苷D抗肝癌作用的藥效學(xué)研究

徐 坤1，2， 舒 展1， 王永林2， 許瓊明1， 楊世林1，2， 劉艷麗1*

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院， 江蘇 蘇州 215123； 2.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550004）

目的 研究白頭翁皂苷 D( 毛茛科植物白頭翁 Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel的干燥根) 體內(nèi)抗小鼠 H22肝癌細(xì)和體外的抗人肝癌 SMMC-7721 作用。 方法 在體外實驗中， 采用 MTT法考察白頭翁皂苷 D對 SMMC-7721 細(xì)胞增殖的抑制作用； 在體內(nèi)實驗中， 采用小鼠 H22實體瘤進(jìn)行體內(nèi)抑瘤實驗， 測定腫瘤生長抑制率， 利用光鏡 (HE染色)、電鏡等方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果 白頭翁皂苷 D處理人肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞 24、 48、 72h 后， 給藥組均出現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞增殖抑制。 白頭翁皂苷 D(4.5、 6.0mg/kg) 對小鼠 H22肝癌細(xì)胞實體瘤的生長有明顯的抑制作用， 抑瘤率分別為 38.67%和 41.59%(P＜0.01， 與模型組比較)。 組織學(xué)觀察顯示， 腫瘤細(xì)胞大量變性壞死， 電鏡下可見凋亡細(xì)胞和凋亡小體。結(jié)論 白頭翁皂苷D具有一定的體內(nèi)、外抗腫瘤作用。

白頭翁皂苷D；肝癌；抗腫瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

白頭翁為毛茛科植物白頭翁 Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel的干燥根， 具有清熱解毒、 涼血止痢、燥濕殺蟲等功效，臨床上用于治療細(xì)菌性痢疾、 婦科陰道炎、 阿米巴痢疾等病癥［1］。 近年來從正品白頭翁中提取的新化學(xué)成分主要為皂苷類［2］。本課題組對白頭翁化學(xué)成分進(jìn)行研究時分離得到白頭翁皂苷 D(pulsatilla saponin D)。

目前對白頭翁抗腫瘤的研究主要集中在其粗提物的體內(nèi)外實驗［3-5］，Yong Kim等［6］研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁皂苷 D對人肺癌 A549 細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒活性， 且對 Lewis肺癌小鼠有顯著的體內(nèi)抑瘤活性。 因此本實驗采用體外 MTT實驗， 初步確定白頭翁皂苷 D的抗肝癌作用， 其次， 建立 H22荷瘤模型，進(jìn)一步觀察白頭翁皂苷D的抗肝癌作用，以期為確定白頭翁抗肝癌作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑 白頭翁皂苷 D(Pulsatilla saponin D)， 蘇州大學(xué)天然藥物教研室提供； 注射用環(huán)磷酰胺 (0.2 g/支)， 批號 10072721， 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。 MTT，美國 Amersco公司； RPMI 1640 培養(yǎng)基， 小牛血清， Gibco公司；其他試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

白頭翁皂苷 D結(jié)構(gòu)鑒定: 白色粉末 (甲醇)，ESI-MS m/z935.2 ［M+Na］+(C47H76O17Na， 計算值 935.2)； Liebermann-Burchard 反應(yīng)呈陽性； Molish 反 應(yīng) 呈 陽 性。1H-NMR(500 MHz， C5D5N) δ: 1.01， 1.01， 1.08， 1.10， 1.17， 1.31(each 3H， s，CH3)，5.54(1H， brs， H-12)， 1.73(3H，brs， 6-H3of rha)， 6.33(1H，brs， 1-H of rha)， 5.06(1H，d， J=8.0 Hz， 1-H of glc) ， 5.19(1H， d， J=6.0 Hz， 1-H of ara)。13C-NMR(125 MHz， C5D5N) δ: 81.18(C-3)，122.72(C-12)， 145.03(C-13)，64.04(C-23)， 180.64(C-28)， 104.54(Cara-1)，76.42(Cara-2)， 75.15(Cara-3)， 80.56(Cara-4)，65.53(Cara-5) 。 101.82(Crha-1)， 72.41(Crha-2)， 72.59(Crha-3)， 74.27(Crha-4)， 69.78 (Crha-5)，18.76(Crha-6)， 106.89(Cglc-1)，75.62(Cglc-2)， 78.93(Cglc-3)， 71.37(Cglc-4)，78.69(Cglc-5)， 62.64(Cglc-6)。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］ 報道一致，故鑒定化合物為白頭翁皂苷 D (pulsatilla saponin D)。結(jié)構(gòu)見圖 1。

1.2 儀器 倒置熒光顯微鏡， eclipse TE2000-U型(日本 Nikon 公司)； Thermo MVLTISKANFC型酶標(biāo)儀 (德國 Thermo Scientific公司)；BB-IS 型二氧化碳培養(yǎng)箱 ( 德國 Thermo Scientific公司)；超凈臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)； 22PC電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)； H-600 型透射式電子顯微鏡 (日本日立公司)。

圖1 白頭翁皂苷D結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of pulsatilla saponin D

1.3 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞 SMMC-7721、 H22腹水型小鼠肝癌細(xì)胞均購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.4 動物 ICR小鼠， 清潔級， 雄性，體質(zhì)量18 ～22 g， 動物合格證號 SCXK(滬)2007—0005。購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的細(xì)胞， 離心去除凍存液， 加入 RPMI-1640 培養(yǎng)液 ( 含體積分?jǐn)?shù) 10%已滅活的小牛血清、 青霉素 l×105U/L、 鏈霉素 100 mg/L)， 于 37 ℃、 5%CO2、 飽和濕度孵箱中靜置培養(yǎng)。次日換液，3～4 d傳代，取指數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

2.2 細(xì)胞增殖抑制實驗 采用 MTT法［8］， 收集對數(shù)生長期 SMMC-7721 人肝癌細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至 1 ×105個/mL， 于 96 孔板每孔加入 100 μL， 置于 5%CO2、 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 至細(xì)胞完全貼壁，加入不同質(zhì)量濃度的白頭翁皂苷D使終 濃 度 分 別 為 3.125、 6.25、12.5、 25、 50 μg/mL， 每個質(zhì)量濃度設(shè)3 個復(fù)孔，藥物與細(xì)胞作用 24、 48、 72h， 終止培養(yǎng)前 4 h 加入 5 mg/mL的MTT 10 μL/孔， 培養(yǎng)結(jié)束后棄上清， 加入 100 μL DMSO振搖 10 min 使結(jié)晶充分溶解， 以酶標(biāo)儀檢測 490 nm處各孔吸光度 A值。 取其均值計算藥物對細(xì)胞增殖抑制率 (%)， 并求其 IC50值， 重復(fù) 3次實驗。

2.3 體內(nèi)抗腫瘤作用［9-10］

2.3.1 小鼠肝癌細(xì)胞 H22荷瘤小鼠模型制備 H22瘤株經(jīng)小鼠腹腔傳3代以上，取腹部明顯膨大小鼠，脫臼處死，酒精消毒，一次性無菌注射器抽取乳白色腹水，置于已滅菌的離心管中，細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)， 用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度至 5 ×106個/mL，每只小鼠右腋下接種 0.2 m L。 小鼠接種瘤細(xì)胞24 h后， 隨機(jī)分為空白組、 模型組、 陽性組 (CTX 20 mg/kg， ip.)、 白 頭 翁 皂 苷 D 給 藥 組 (3.0、4.5、6.0 mg/kg， ip.)，每組 12 只?？瞻捉M及模型組用空白溶媒每天腹腔注射 0.2 mL/只； 陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺 20 mg/kg， 隔日 1 次； 白頭翁皂苷 D(3.0、4.5、6.0mg/kg， ip.)，連續(xù)給藥10 d， 每天稱取小鼠體質(zhì)量。 最后一次給藥后 24 h， 剝離瘤體， 稱取瘤質(zhì)量， 并計算抑瘤率。

2.3.2 腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將各組腫瘤組織放入 10%甲醛液中， 石蠟包埋， 切片并進(jìn)行 HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。取各組小鼠腫瘤組織，按電鏡標(biāo)本常規(guī)處理，透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)并拍照。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 體外對人肝癌細(xì)胞生長抑制作用

經(jīng)不同質(zhì)量濃度白頭翁皂苷D處理后，人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721 細(xì)胞的生長受到不同程度的抑制， 并呈濃度、 時間相關(guān)。 當(dāng)白頭翁皂苷 D 50 μg/mL時， 作用 SMMC-7721 細(xì)胞 24、 48、 72 h 的增殖抑制率分別為 84.26%、 92.12%及 93.48%，其 IC50值 分 別 為 (7.17 ±2.92)、(5.73 ±1.59) 及(6.53 ±1.42) μg/mL。結(jié)果見表 1。

表 1 白頭翁皂苷 D 對人肝癌細(xì)胞 S MMC-7721 增殖的影響 （）Fig.1 Effects of pulsatilla saponin D on human liver cancer cell SMMC-7721 （）

表 1 白頭翁皂苷 D 對人肝癌細(xì)胞 S MMC-7721 增殖的影響 （）Fig.1 Effects of pulsatilla saponin D on human liver cancer cell SMMC-7721 （）

注:與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01

組別質(zhì)量濃度/ (μg·m L-1) 7721 細(xì)胞 A值24 h(增殖抑制率/%)48 h(增殖抑制率/%)72 h(增殖抑制率/%)對照00.741 4 ±0.027 0(0)1.394 4 ±0.481 8(0)2.270 9 ±0.281 5(0)白頭翁皂苷 D3.1250.452 6 ±0.074 3*(39.08)0.738 2 ±0.294 1*(46.88)1.256 4 ±0.037 0**(44.27) 6.250.400 5 ±0.128 1**(46.33)0.716 5 ±0.201 4*(47.39)1.176 4 ±0.316 5**(48.48) 12.50.291 8 ±0.039 0**(60.66)0.573 9 ±0.183 9**(58.49)1.087 6 ±0.223 0**(52.38) 250.265 4 ±0.038 8**(64.24)0.433 6 ±0.194 3**(68.88)0.722 9 ±0.286 4**(68.73) 500.117 4 ±0.036 3**(84.26)0.106 8 ±0.026 0**(92.12)0.145 3 ±0.080 8**(93.48) 5-FU250.584 5 ±0.055 9(21.26)0.580 9 ±0.228 9*(58.79)0.205 5 ±0.085 4**(91.14)

3.2 體內(nèi)抗腫瘤作用

3.2.1 對小鼠肝癌細(xì)胞 H22荷瘤的影響 與模型組相比，白頭翁皂苷D各個劑量組小鼠瘤質(zhì)量明顯降低 (P＜0.01)； 環(huán)磷酰胺組瘤質(zhì)量也顯著減低 (P＜0.01)。 白頭翁皂苷 D 4.5、 6.0 mg/kg劑量組 的 抑 瘤 率 分 別 為 38.67%、 41.59%， 陽 性(CTX) 組為 55.59%。 結(jié)果見表 2。

表 2 白頭翁皂苷 D 對小鼠肝癌細(xì)胞 H22荷瘤小鼠的影響（）Tab.2 Effect of Pulsatilla saponin D on H22cells in tumorbearing m ice（）

表 2 白頭翁皂苷 D 對小鼠肝癌細(xì)胞 H22荷瘤小鼠的影響（）Tab.2 Effect of Pulsatilla saponin D on H22cells in tumorbearing m ice（）

注: 與模型組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，**P＜0.01

組別劑量/ (mg·kg-1)體質(zhì)量/g始末瘤質(zhì)量/g抑瘤率/%模型-24.6 ±1.4 33.6 ±3.71.767 ±0.726-白頭翁皂苷 D3.024.8 ±1.3 28.8 ±2.41.250 ±0.526*29.27 4.524.9 ±1.5 26.8 ±2.41.084 ±0.419**38.67 6.025.1 ±1.5 25.8 ±1.51.032 ±0.460**41.59環(huán)磷酰胺(CTX)2024.3 ±1.5 29.7 ±2.70.785 ±0.262**55.59

3.2.2 腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下觀察， 模型組腫瘤細(xì)胞多呈團(tuán)灶狀分布，有的呈腺樣排列，有的沿骨骼肌呈侵襲性生長， 將骨骼肌分離。 CTX組腫瘤細(xì)胞呈彌漫性分布，可見大量壞死細(xì)胞，細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失。白頭翁皂苷D處理組腫瘤細(xì)胞呈彌漫性分布，細(xì)胞大小不等，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核深染、出現(xiàn)異形和固縮，可見腫瘤細(xì)胞大量壞死，壞死區(qū)周圍可見凋亡細(xì)胞，且呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果見圖2。

電鏡下觀察，模型組腫瘤細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核較大， 結(jié)構(gòu)完整， 核膜清晰，核仁明顯；CTX組腫瘤細(xì)胞大部分發(fā)生崩解、壞死現(xiàn)象，染色質(zhì)凝集成塊，胞質(zhì)內(nèi)無明顯細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，呈溶解樣改變，可見凋亡小體。白頭翁皂苷D給藥組腫瘤細(xì)胞體積變小，細(xì)胞表面微絨毛減少或消失，核異染色質(zhì)濃縮成塊，向核周邊凝集，核周間隙增寬，可見凋亡小體。 結(jié)果見圖3。

4 討論

圖2 HE染色病理切片觀察Fig.2 HE staining for pathological observation

圖3 透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.3 U ltrastructu re of tum or cells was observed under the transm ission electron m icroscope

惡性腫瘤是目前危害人類生命健康的嚴(yán)重疾病之一，據(jù)統(tǒng)計，每年全球肝癌發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率的第 5 位， 死亡率居第 3 位［11］。 而我國每年死于肝癌的人數(shù)約為 11萬， 占全世界肝癌死亡人數(shù)的 45%［12］。 化學(xué)治療一直是臨床上治療腫瘤的主要手段之一，特別是對不適于手術(shù)治療或放射治療的患者。目前臨床上應(yīng)用的廣譜抗腫瘤藥物如鉑類化合物、長春堿類藥物等，往往因較嚴(yán)重的毒副作用而限制了它們的臨床應(yīng)用［13］。 為開發(fā)新型抗腫瘤藥物，我們對白頭翁皂苷D進(jìn)行較系統(tǒng)的研究。

本次實驗的給藥劑量是參照本課題組在其它類白頭翁單體抗腫瘤實驗中的劑量以及前期預(yù)試實驗的劑量設(shè)定， 具體參照本課題組相關(guān)專利［14］。 在前期預(yù)試實驗中，環(huán)磷酰胺體內(nèi)表現(xiàn)出了良好的體內(nèi)抗腫瘤活性和穩(wěn)定性。然而，在體外實驗中未表現(xiàn)出良好的活性和穩(wěn)定性， 氟尿嘧啶 (5-FU) 卻表現(xiàn)出了很好的穩(wěn)定性及活性。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有的文獻(xiàn)報道在體內(nèi)外實驗時采用了不同的陽性藥［15-16］。 所以本 次 實 驗 分 別 選 擇 5-FU、 環(huán) 磷酰胺 (CTX) 為體外和體內(nèi)試驗陽性藥進(jìn)行研究。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)， 人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721 經(jīng)3.125 ～50 μg/mL的白頭翁皂苷 D處理 24 h、 48 h 及 72 h后，其細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，表明其對體外肝癌細(xì)胞生長有良好的抑制作用且呈劑量依賴性。體內(nèi)實驗結(jié)果證實，白頭翁皂苷D對小鼠肝癌細(xì)胞 H22荷瘤生長有明顯的抑制作用， HE染色、電鏡顯示，白頭翁皂苷D給藥組腫瘤細(xì)胞大量壞死或凋亡，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核變小，可見凋亡小體等，提示其對肝癌細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，作用機(jī)制可能與促腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本實驗為尋找抗腫瘤高效低毒的先導(dǎo)化合物提供理論依據(jù)，但其抗腫瘤作用機(jī)制及其與荷瘤機(jī)體免疫功能之間的關(guān)系，尚有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Pulsatilla saponin D on hepatocarcinoma in vivo and in vitro

XU Kun1，2， SHU Zhan1， WANG Yong-lin2， XU Qiong-ming1， YANG Shi-lin1，2， LIU Yan-li1*

(1.Department of Pharmacy， Soochow University， Suzhou 215123， China； 2.Department of Pharmacy， Guiyang University of Medicine， Guiyang 550004， China)

AIM To study the effect of Pulsatilla saponin D from root of Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel on human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 in vitro andmouse H22hepatoma carcinoma cell in vivo.M ETHODS In vitro experiments，MTT assay was used to evaluate proliferational inhibition of P.saponin D on SMMC-7721 cells.In vivo experiments， ICR mice were used to establish H22hepatoma carcinoma cell tumor model.The suppression ratio of H22hepatoma carcinoma cell growth was determined.The morphologic and apoptotic body were evaluated by lightmicroscope(HE staining)and electronmicroscope.RESULTS Medication groups showed different levels of SMMC-7721 cells proliferation inhibition after24 h， 48 h， 72 h with P.saponin D.Marked inhibitory effect of Pulsatilla saponin D on the transplanted hepatocellular carcinoma H22was observed in the tumor-bearing mice.The inhibitory rateswere 38.67%and 41.59%respectively at the dose of 4.5 and 6.0 mg/kg P.saponin D， respectively.(P＜0.01 vs.modelgroup).Histopathological examination revealed widespread necrosiswith massive accumulation of infiltrating lymphocytes and plasmacytes in the tumors.Numerous apoptotic cells and apoptotic bodieswere observed in the tumors under the electron microscope.CONCLUSION Pulsatilla saponin D has anti-tumor effects in vivo and in vitro.

Pulsatilla saponin D；liver cancer； anti-tumor； cell proliferation； apoptosis

R966

:A

:1001-1528(2014)02-0240-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.005

2013-03-04

重大新藥創(chuàng)制國家科技 重大專 項 (2011ZX09102-001-19) ； 國家自 然科學(xué)基金 青年基金 (81102818) ； 國家自然 科學(xué) 基金(81273402)

徐 坤 (1988—) ， 男， 碩士生， 研究方向: 中藥活性成分。 Tel:15185996322 ， E-mail:xukun1633@126.com

*通信作者: 劉艷麗 (1974-) ， 女， 副教授， 研究方向: 中藥抗腫瘤。 Tel:(0512)69561421， E-mail:liuyanli@suda.edu.cn