成炳祥 方煊 朱承良 等

成炳祥1 方 煊1 朱承良1 秦運升2 莊 莉2

1.浙江省紹興第二醫(yī)院外科，浙江紹興 312000；2.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院肝膽外科，浙江杭州 310003

[摘要] 目的 探討索拉非尼治療前后對肝癌患者血清中腫瘤相關(guān)miRNA表達譜改變情況。 方法 收集2011年10月～2012年9月在紹興第二醫(yī)院及浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院接受治療的6例肝癌患者的血清樣本，采用miRNA表達譜芯片檢測HCC患者經(jīng)索拉非尼治療前后血清中差異表達的miRNAs，并應(yīng)用實時熒光定量PCR（RT-PCR）對篩選出的miRNAs進行驗證。 結(jié)果 索拉非尼治療前后肝癌患者血清miRNA表達譜出現(xiàn)明顯改變，16個miRNAs在索拉非尼治療后肝癌患者血清中表達明顯升高，10個miRNAs在索拉非尼治療后肝癌患者血清中表達明顯降低。治療前肝癌患者血清miR-122相對表達值為（1.07±0.32），治療1個月后的miR-122相對表達值為（9.10±1.89），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），較治療前表達水平顯著上調(diào)。 結(jié)論 索拉非尼治療前后肝癌患者血清中表達譜發(fā)生明顯變化，索拉非尼對肝癌相關(guān)miRNAs的調(diào)控可能是其治療腫瘤的重要機制之一。

[關(guān)鍵詞] miRNA芯片；索拉非尼；肝細胞癌；血清

[中圖分類號] R575.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）03（c）-0041-04

Altered expression levels of miRNAs in serum of patients with hepatocellular carcinoma in the treatment of Sorafenib

CHENG Bingxiang1 FANG Xuan1 ZHU Chengliang1 QIN Yunsheng2 ZHUANG Li2

1.Department of Surgery， Shaoxing Second Hospital， Zhejiang Province， Shaoxing 312000， China； 2.Department of Hepatobiliary Surgery， the First Affiliated Hospital， College of Medicine， Zhejiang University， Zhejiang Province， Hangzhou 310003， China

[Abstract] Objective To investigate the differential expression of miRNAs in serum of patients with hepatocellular carcinoma （HCC） in the treatment of Sorafenib. Methods Blood samples in 6 patients with HCC in Shaoxing Second Hospital and the First Affiliated Hospital， College of Medicine， Zhejiang University from October 2011 to September 2012 were selected. The miRNA microarray was chosen to assess the level and composition of miRNAs in serum of patients with HCC in the treatment of Sorafenib. Reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to validate the data of miRNA microarray. Results There were significant changes in some miRNAs in serum of patients with HCC post Sorafenib treatment （10 miRNAs were more than 2-fold down-regulated and 16 miRNAs were more than 2-fold up-regulated）. Relative expression values of miR-122 before the treatment was （1.07±0.32）， the expression values of miR-122 1 month after the treatment was （9.10±1.89）， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Sorafenib treatment can make significant changes in the spectra and levels of serum miRNAs in patients with HCC， the regulation of HCC related miRNAs by Sorafenib may be one important mechanism of treatment of cancer.

[Key words] miRNA microarray； Sorafenib； Hepatocellular carcinoma； Serum

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其進展迅速，對放化療不敏感，手術(shù)切除后易轉(zhuǎn)移復發(fā)，因而在我國惡性腫瘤的病死率中，肝癌占第2位[1]。索拉菲尼是一種新型的口服多激酶抑制劑，其通過對Raf/絲裂原活性蛋白激酶/細胞外信號轉(zhuǎn)導通路（Raf/MEK/ERK）和血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）-1，2，3等通路的抑制調(diào)控，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和阻斷腫瘤新生血管形成的雙重抗腫瘤作用[2-3]。目前臨床研究證實，索拉非尼的使用可以有效提高肝癌患者的生存時間[4-5]。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于人體中，不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA（20～25 nt），在細胞生長和凋亡、干細胞分化、胚胎后期發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[6-7]。值得關(guān)注的是，miRNAs表達譜和表達水平在肝癌腫瘤組織和患者血清中均出現(xiàn)較明顯的變化，提示miRNA對于肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用[8]。本研究采用miRNA芯片技術(shù)檢測索拉菲尼治療前后對肝癌患者血清中腫瘤相關(guān)miRNA表達譜改變情況，為進一步研究索拉菲尼治療肝癌的機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年10月～2012年9月在紹興第二醫(yī)院及浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院接受治療的6例肝癌患者的血清樣本。所有患者均經(jīng)組織病理學檢測證實為肝細胞肝癌，診斷均符合2001年肝癌臨床診斷標準和臨床分期。所選病例應(yīng)同時滿足以下條件：不適合手術(shù)治療，體力狀況ECOG評分≤2分，Child-Pugh評分A、B級，預計生存時間>12周，血小板（PLT）≥ 60×109/L，血紅蛋白（Hb）≥85 g/L，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）≤正常值上限3倍以內(nèi)。本組研究對象中男4例，女2例，平均年齡（52.6±14.8）歲；腫瘤直徑8.7～15.4 cm；病灶數(shù)目1～3個，其中單發(fā)2例、多發(fā)4例；甲胎蛋白（AFP）平均值（837.42±178.75）ng/mL。

1.2 主要試劑和儀器

mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Ambion公司，美國）；miScript Reverse Transcription Kit（Qiagen公司，德國）；SYBR Green I（10000×）和PlatinumR Taq DNA聚合酶（Invitrogen公司，美國）；MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑（epicentre公司，美國）；miRNA芯片由丹麥Exiqon公司制作，上?？党缮锕こ逃邢薰敬?；DU-730紫外分光光度計和PRISM 7900實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）；miR-122及U6引物序列由閱微基因技術(shù)有限公司合成。

1.3 藥物干預

索拉非尼（商品名：多吉美，拜耳公司；批號：H20060296）采用統(tǒng)一的給藥方式，400 mg/次，2次/d，口服，服藥前禁食2 h。比較患者服藥前和服藥1個月后各項指標。

1.4 血清樣本的收集

所有患者服藥前和服藥1個月后空腹采集外周靜脈血5 mL，室溫下靜置60 min。然后在4℃，3000 r/min條件下離心15 min，取上清（血清）保存于-80°C冰箱待下一步實驗。

1.5 miRNA表達譜芯片檢測

①總RNA和miRNA的提取按照mirVanaTM miRNA Isolation Kit和mirVanaTM RNA Isolation Kit說明書步驟進行操作。DU-730紫外分光光度計進行RNA定量，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。②制備熒光標記探針：采用miRCURYTM Array Power標記試劑盒，用標記酶將Hy3TM：熒光基團標記miRNA制備熒光標記探針。③miRNA芯片雜交、圖像掃描和數(shù)據(jù)分析：在標準條件下將制備好的熒光標記探針和miRCURYTM芯片放入PhalanxTM的熱收縮雜交袋進行雜交。使用GenePix 4000B芯片掃描儀對雜交好的芯片進行掃描并收集熒光強度信號，圖像生成后使用Genepix Pro 6.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行分析運算，并將實驗結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存。芯片實驗數(shù)據(jù)分析軟件MeV4.0對數(shù)據(jù)進行聚類分析，計算兩種檢測信號的比值（log2）。

1.6 Real time RT-PCR驗證

基于芯片結(jié)果對miR-122進行驗證。采用stem-loop進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件如下：16℃，30 min；42℃，40 min；85°C，5 min。采用Sybergreen Ⅰ方法進行Realtime PCR反應(yīng)。按以下程序進行擴增：95℃，10 min；40個PCR循環(huán)（95℃，15 s；60℃，60 s），擴增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72°C緩慢加熱到99℃以建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線（每5秒升高1℃），實驗重復3次，以U6 snRNA作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法對miR-122的表達進行分析。

1.7統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA表達譜差異情況

所有血清樣本中提取的RNA，通過紫外定量和瓊脂糖凝膠電泳分析顯示RNA完整性較好，質(zhì)量符合要求芯片檢測的要求。miRNA芯片內(nèi)置約1700個miRNA捕獲探針，通過應(yīng)用SAM軟件分析miRNA表達譜芯片，結(jié)果顯示，同治療前相比，服用索拉非尼1個月后肝癌患者血清miRNA表達譜中存在16個明顯上調(diào)的miRNAs和10個明顯下調(diào)的miRNAs；特別是miR-122，其表達上升幅度大于10倍。見表1。

2.2 Real-time RT-PCR驗證miR-122

以U6 snRNA為內(nèi)參，通過Real-time RT-PCR檢測索拉非尼治療前后肝癌患者血清中的miR-122表達水平的差異。結(jié)果顯示，治療前肝癌患者血清miR-122相對表達值為（1.07±0.32），索拉非尼治療1個月后肝癌患者血清中的miR-122相對表達值為（9.10±1.89），較治療前表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），與芯片的結(jié)果一致。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測miR-122在索拉菲尼治療前后

肝癌患者血清中的表達

3 討論

索拉非尼是拜耳公司和ONYX公司共同研制的一種小分子多靶點的生物靶向治療新藥。2005年首次被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于治療晚期腎細胞癌。此后，臨床研究發(fā)現(xiàn)，索拉非尼可以顯著提高晚期肝癌患者的生存時間[9]。因此，索拉非尼已被FDA和我國原國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準為治療晚期肝細胞癌唯一有效的分子靶向藥[4]。

索拉非尼治療惡性腫瘤的作用機制復雜，主要通過作用于多靶點實現(xiàn)抑制腫瘤增殖及新血管形成，從而達到殺傷腫瘤的目的。主要包括：抑制位于腫瘤血管生成信號轉(zhuǎn)導路徑的上游及腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導路徑的上游的Raf/絲裂原活性蛋白激酶/細胞外信號轉(zhuǎn)導通路（Raf/MEK/ERK）；抑制人VEGFR-1，2，3、血小板衍生生長因子受體（PDGFR）-β、FMS樣酪氨酸激酶3（FLT3）和c-Kit原癌基因的酪氨酸激酶活性；抑制Mcl-1基因翻譯，c-Kit蛋白以及致癌性RET受體酪氨酸激酶等[10-11]。然而，索拉非尼抗惡性腫瘤的作用機制尚未完全闡明。

miRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類廣泛影響/調(diào)節(jié)機體內(nèi)的各種細胞生物學過程和調(diào)節(jié)途徑的小RNA分子。大量的研究證實，miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起著非常重要的作用[12]，惡性腫瘤患者腫瘤組織和血清中miRNAs的表達往往是失調(diào)的，且這種異常改變與腫瘤的形成、生長、復發(fā)、轉(zhuǎn)移以及預后是密切相關(guān)的[8，13]。

miR-122是目前證實的在肝細胞中特異性高表達的一種miRNA，其前體定位于人類18號染色體18q21.31上，是來源于hcr基因轉(zhuǎn)錄本且肝臟中特異性高表達的一種miRNA。生理狀態(tài)下，miR-122在調(diào)控肝臟的細胞發(fā)育、調(diào)節(jié)細胞代謝和誘導細胞分化等生命活動過程中發(fā)揮重要作用[14]。研究顯示，miR-122與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。肝癌細胞中miR-122的表達明顯下調(diào)，其在肝癌的發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出抑癌基因的功能。Cyclin G1、Wnt1、β-catenin、Igf1R、ADAM-17、TCF-4和Bcl-w等致癌基因被證實為miR-122的下游靶基因[15]。此外，有研究表明，人為上調(diào)肝癌細胞中miR-122的表達可以提高腫瘤細胞對索拉非尼的敏感性[16-17]。

本次實驗采用的是基于LNATM技術(shù)捕獲探針的miRNA芯片來檢測索拉非尼治療前后對肝癌患者血清中腫瘤相關(guān)miRNA表達譜改變情況。將表達豐度改變≥2倍作為篩選差異顯著miRNA的評定標準。結(jié)果顯示，同治療前相比，服用索拉非尼1月后肝癌患者血清miRNA表達譜中存在16個明顯上調(diào)的miRNAs和10個明顯下調(diào)的miRNAs；特別是miR-122，其表達上升幅度大于10倍。Real time PCR進一步驗證miR-122，結(jié)果顯示與芯片結(jié)果一致，提示miR-122可能參與索拉非尼對肝癌的治療，但是具體的機制還需要進一步研究。

綜上所述，本次研究結(jié)果顯示，索拉非尼治療能導致肝癌患者血清中腫瘤相關(guān)miRNA表達譜發(fā)生明顯改變。提示索拉非尼對肝癌相關(guān)miRNAs的調(diào)控可能是索拉非尼治療肝癌的重要機制之一。通過人工上調(diào)相關(guān)miRNAs（如miR-122）的表達，可能增強索拉非尼對肝癌的療效，這對于晚期肝癌的非手術(shù)治療將有很大應(yīng)用價值。

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