黃秀芳+原向偉

[摘要] 目的 探討Sox9和Ⅱ型膠原蛋白（Col2al）在人類腰椎間盤退變中的表達及意義。 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)在退變和正常腰椎間盤組織中分別檢測Sox9和Ⅱ型膠原蛋白的表達，并分析其相關(guān)性。 結(jié)果 實驗組Sox9染色陽性率為20.0%（6/30），對照組Sox9染色陽性率為76.7%（23/30），兩組間染色陽性率有顯著性差異（P<0.05）。實驗組Col2al染色陽性率為33.3% （10/30），對照組Col2al染色陽性率為83.3% （25/30），兩組間染色陽性率有顯著性差異（P<0.05）。退變腰椎間盤中6例Sox9陽性者中，僅1例Col2al表達陰性，而在10例Col2al表達陽性者中，5例Sox9表達陰性，二者同時陽性5例，同時陰性表達19例。退變椎間盤中Sox9和Col2al的表達呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論Sox9和Ⅱ型膠原蛋白表達降低與腰椎間盤退變有關(guān)， Sox9可能通過下調(diào)Col2al的表達，共同參與腰椎間盤退變。

[關(guān)鍵詞] Sox9；Ⅱ型膠原蛋白；腰椎間盤退變；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R363.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）03-18-04

隨著老齡化社會在中國的到來，頸、腰椎椎間盤退變所致頸肩痛、腰腿痛的發(fā)病率已逐漸增高，并且每年均要耗費相當(dāng)?shù)娜肆ω斄M行治療。其治療手段主要包括保守治療和手術(shù)治療，然而無論是脫水、鎮(zhèn)痛、理療等保守治療還是各種微創(chuàng)或開放手術(shù)方法均不能從根本上阻止椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展，并且手術(shù)治療還可能破壞脊柱運動的生理完整性，具有易復(fù)發(fā)、胃腸道反應(yīng)等風(fēng)險和并發(fā)癥[1]。因此在已有研究基礎(chǔ)上，針對椎間盤退變的靶點基因，通過基因治療的方法來阻止或改變椎間盤退變，以成為頸腰椎疾病基礎(chǔ)研究的熱點課題之一。

Sox9（SRY related high mobility group box gene 9）基因最早是作為早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因而被發(fā)現(xiàn)，但在之后的研究中逐漸被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控軟骨細胞發(fā)育、成熟的重要功能[2-3]。比如在關(guān)節(jié)炎患者中致炎因子通過抑制Sox9的軟骨調(diào)控作用，減弱病變軟骨的再生和修復(fù)，從而引起關(guān)節(jié)炎遷延不愈[4]。而同樣以軟骨樣細胞為主的椎間盤組織中Sox9基因的表達情況如何呢？我們采用免疫組織化學(xué)研究腰椎間盤退變臨床標本中Sox9及其下游Col2al（Ⅱ型膠原蛋白）的表達情況，并探討其機制，以期為分子水平預(yù)防和治療人類椎間盤退變性疾病提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2010年1月～2012年12月于我院住院因腰椎間盤突出癥、腰椎滑脫、腰椎管狹窄等入院后路手術(shù)所取得的腰椎間盤患者30例作為實驗組，患者年齡均>50歲，其中男16例，女14例，標本均經(jīng)病理證實為退變椎間盤。選取腰椎外傷后路手術(shù)取出腰椎間盤標本30例作為對照組，患者年齡16～30歲，標本均經(jīng)病理證實為正常椎間盤，其中男18例，女12例。

1.2 主要試劑

Sox9兔多克隆抗體、Col2al鼠抗人單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，即用型超敏S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色液為福州邁新生物工程有限公司產(chǎn)品。多聚賴氨酸購自sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本制備 標本均經(jīng)4%多聚甲醛固定6～8h。常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm切片，采用HE染色和免疫組化染色。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 采用S-P免疫組織化學(xué)染色超敏試劑盒，按期說明書進行實驗。石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗5min×2次，蒸餾水新鮮配制3%過氧化氫液，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗3min×3次。將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐加熱沸騰，5～10min后，反復(fù)1～2次；PBS洗3min×3次，封閉血清37℃孵育10min；滴加一抗，4℃孵育12h，PBS洗3min×3次；滴加生物素標記的二抗，37℃孵育10min，PBS洗3min×3次；滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，37℃孵育10min，PBS洗3min×3次；滴加DAB顯色劑，鏡下確定反應(yīng)時間終止。顯色完成后，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3.3 染色結(jié)果的判斷標準 Sox9位于胞核，Col2al位于胞漿，陽性細胞染色呈棕黃色，隨機計數(shù)10個視野，陰性（-）判定為無陽性細胞或陽性細胞比例<10%，弱陽性（+）判定為陽性細胞比例10%～30%，中度陽性（++）判定為陽性細胞比例30%～60%，強陽性（+++）判定為陽性細胞數(shù)>60%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計，兩樣本率的差別檢驗采用x2檢驗，相關(guān)性檢驗采用2×2列聯(lián)表關(guān)聯(lián)性分析，以α=0.05作為檢驗標準。

2 結(jié)果

2.1 退變腰椎間盤中Sox9的表達

陽性細胞胞核呈棕黃色（圖1A）。實驗組Sox9染色陽性率為20.0%（6/30），其中陰性（-）24例，弱陽性（+）2例，中度陽性（++）3例，強陽性（+++）1例。對照組Sox9染色陽性率為76.7%（23/30），其中陰性（-）7例，弱陽性（+）6例，中度陽性（++）10例，強陽性（+++）7例。兩組間染色陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 退變腰椎間盤中Col2a1的表達

陽性細胞胞漿呈棕黃色（圖1B）。實驗組Col2al染色陽性率為33.3%（10/30），其中陰性（-）20例，弱陽性（+）5例，中度陽性（++）3例，強陽性（+++）2例。對照組Col2al染色陽性率為83.3%（25/30），其中陰性（-）5例，弱陽性（+）2例，中度陽性（++）10例，強陽性（+++）13例。兩組間染色陽性率有顯著性差異（P<0.05）。見表2。endprint

2.3 退變腰椎間盤中Sox9表達和Col2al表達的關(guān)系

退變腰椎間盤中6例Sox9陽性者中，僅1例Col2al表達陰性，而在10例Col2al表達陽性者中，5例Sox9表達陰性，二者同時陽性5例，同時陰性表達19例。退變椎間盤中Sox9和Col2al的表達呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。見表3。

3 討論

隨著我國老齡化社會的到來，由椎間盤退變造成的頸、腰椎疾病發(fā)病率逐漸增高，并嚴重影響患者生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變是一系列脊柱退行性疾病的根本病理基礎(chǔ)，其不僅表現(xiàn)為組織形態(tài)學(xué)的變化，而且表現(xiàn)為椎間盤基質(zhì)生化組成與性質(zhì)的系統(tǒng)性改變，并可直接導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)功能的減退和喪失，誘發(fā)脊柱不穩(wěn)定的發(fā)生，其結(jié)局往往是椎管狹窄、脊柱節(jié)段不穩(wěn)、骨贅形成、椎間盤突出及隨之而來的神經(jīng)根、脊髓受壓等[5]，在中老年患者中，手術(shù)治療存在風(fēng)險和復(fù)發(fā)、神經(jīng)功能損害等并發(fā)癥。

目前來看，椎間盤退變的分子機理仍不完全清楚，但椎間盤組織中部分軟骨調(diào)控相關(guān)基因表達異常導(dǎo)致的功能障礙與其相關(guān)[6]。Sox9基因最早是作為早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因而被發(fā)現(xiàn)[7-8]，此外，Sox9發(fā)生基因突變（包括點突變、短尾突變等），將導(dǎo)致短指畸形，原因為正常的軟骨形成過程被擾亂[9]。而在骨性關(guān)節(jié)炎患者，患處炎性因子表達明顯增強，從而抑制Sox9基因的軟骨生成作用，進一步減弱了病變軟骨的再生和修復(fù)，成為炎癥遷延不愈的重要原因[10]。表明Sox9基因也是調(diào)控軟骨形成和功能的重要基因。本研究也發(fā)現(xiàn)在退變的人腰椎間盤組織中，Sox9的表達相對于正常椎間盤存在明顯下調(diào)，同樣的現(xiàn)象也在頸椎間盤退變標本中發(fā)生[11]，表明在Sox9的異常表達與人類椎間盤退變的確存在重要聯(lián)系。但Sox9的表達下調(diào)究竟隨著年齡是線性還是跳躍性進展仍不清楚，我們傾向認為線性進展。30～50歲之間的腰椎間盤突出發(fā)病率并不高，我們并未將之納入研究，對此部分患者的研究可能回答上述問題，這是我們下一步工作的設(shè)想。

椎間盤的主要成分是水、膠原和蛋白多糖，正常情況下纖維環(huán)中含有60%Ⅱ型膠原和40%Ⅰ型膠原，因此膠原的退化和減少也是椎間盤退變的主要組成部分。軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原蛋白由Col2a1基因編碼[12]，我們發(fā)現(xiàn)退變的人腰椎間盤組織中，Col2a1的表達相對于正常椎間盤也存在明顯下調(diào)，Col2a1的低表達導(dǎo)致Ⅱ型膠原蛋白合成減少，軟骨退化，修復(fù)降低，最終引起椎間盤退變。對于Col2a1和Sox9之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)二者存在明顯的正向相關(guān)，提示二者可能處于同一信號通路。事實上Sox9可通過轉(zhuǎn)位入細胞核，直接結(jié)合Col2a1的增強子、或與其他蛋白形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體結(jié)合Cola1的啟動子E-box等多種方式，調(diào)控其表達[13-15]。這些研究均表明Col2a1是Sox9的下游靶基因，轉(zhuǎn)錄因子Sox9基因可正向調(diào)控軟骨細胞中Col2a1的表達，通過促進Ⅱ型膠原蛋白的表達而促進軟骨的發(fā)育和成熟，而當(dāng)退變發(fā)生Sox9基因表達降低時會下調(diào)Col2a1的表達而致Ⅱ型膠原蛋白合成減少，最終進一步加重椎間盤退變。

目前隨著分子生物學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，基因治療逐漸成為一種切實可行的治療手段。有學(xué)者通過腺病毒介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染將重組BMP2（人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2）導(dǎo)入兔椎間盤退變細胞，可引起Sox9的高表達，進一步增加Col2al的表達，從而增強Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達合成[16-17]。而腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的Sox9過表達可改善關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)[18]，所以Sox9是一個逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的潛在基因治療靶點。我們期望通過本項目的工作，能為治療椎間盤退變提供了一條新的思路。

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