劉貴深于濤

（1.潮州市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，潮州 521011；2.新鄉(xiāng)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000）

食源性沙門氏菌耐藥性及質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因檢測(cè)

劉貴深1于濤2

（1.潮州市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，潮州 521011；2.新鄉(xiāng)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453000）

隨機(jī)采集的638份食品樣品中沙門氏菌總檢出率為9.7%（n=62株），共檢出16種不同的血清型，其中最常見(jiàn)的為鴨沙門氏菌。受試菌株對(duì)磺胺甲基異噁唑、復(fù)方新諾明、鏈霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率較高。16株耐環(huán)丙沙星沙門氏菌按GyrA和ParC喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）不同氨基酸替代組合可分為5種突變型，其中GyrA亞基發(fā)生Ser83Phe和Asp87Gly變異，同時(shí)ParC亞基發(fā)生Ser80Arg變異為最常見(jiàn)的突變類型。62株食源性沙門氏菌中，qnr基因陽(yáng)性的菌株共7株，占受試菌株的11.3%。qnrA和qnrS基因陽(yáng)性菌株分別有2株和5株，沒(méi)有菌株攜帶qnrB、qnrC和qnrD基因。aac（6'）-Ib基因陽(yáng)性菌株共有8株，其中3株經(jīng)確認(rèn)為攜帶其變體基因aac（6'）-Ib-cr。結(jié)果表明，新鄉(xiāng)市食源性沙門氏菌血清型分布呈多樣性，耐藥狀況較為嚴(yán)重，并且一些菌株攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥（PMQR）基因。

食源性 沙門氏菌 耐藥性 質(zhì)粒介導(dǎo) 喹諾酮類

沙門氏菌是一種重要的食源性致病菌。資料顯示，中國(guó)70%-80%的細(xì)菌性食物中毒是由沙門氏菌引起的，沙門氏菌作為食源性致病菌所引起的危害在不斷擴(kuò)大［1-3］。沙門氏菌的許多血清型，如腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，均可導(dǎo)致宿主產(chǎn)生腹瀉等食源性疾?。?］。近年來(lái)，由于抗生素在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和臨床治療中的廣泛使用甚至是不遵守規(guī)則的濫用，導(dǎo)致沙門氏菌的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重［5，6］。喹諾酮類抗生素是由萘啶酸發(fā)展起來(lái)的全合成抗菌藥物，具有獨(dú)特的作用機(jī)制、優(yōu)秀的藥物動(dòng)力學(xué)性能和抗菌活性等特性，已成為人類臨床及動(dòng)物疾病治療和預(yù)防的常用藥物。以往研究顯示，沙門氏菌對(duì)喹諾酮類的耐藥主要由喹諾酮耐藥決定區(qū)（Quinolone resistance-determining region，QRDR） 的靶位改變和主動(dòng)外排所致，兩者均由染色體介導(dǎo)［7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥（Plasmidmediated quinolone resistance，PMQR）是其耐藥性傳播的主要途徑［7］。現(xiàn)已報(bào)道的PMQR機(jī)制有3類，即qnr家族、aac（6'）-Ib-cr和喹諾酮類藥物特異性外排泵qepA。然而，目前對(duì)沙門氏菌PMQR機(jī)制的研究多集中于人類臨床分離株，對(duì)食源性沙門氏菌的報(bào)道較少。

細(xì)菌耐藥菌株的傳播和多重耐藥菌株的出現(xiàn)是導(dǎo)致各類傳染病治愈率受限制的主要原因之一［8］，且耐藥菌株可以通過(guò)多種途徑傳播并經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體。研究食源性沙門氏菌的藥敏特征及耐藥機(jī)制有助于從食物鏈的源頭和食品性動(dòng)物生產(chǎn)中采取合理的干預(yù)措施，從而減少和防止沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生，保障食品安全。為此，本研究對(duì)新鄉(xiāng)市4類食品樣品中沙門氏菌的污染狀況進(jìn)行了調(diào)查，分析菌株的血清分布和耐藥性；同時(shí)對(duì)食源性沙門氏菌的QRDR靶位突變以及PMQR的流行情況進(jìn)行檢測(cè)，旨在更好地了解食源性沙門氏菌對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 以新鄉(xiāng)市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市、大賣場(chǎng)和部分副食品經(jīng)營(yíng)單位為對(duì)象，按照隨機(jī)采樣原則和食品微生物學(xué)檢驗(yàn)采樣的要求，共采集4類食品樣品638份，其中生肉367份（包括豬肉、牛肉、雞肉和羊肉），水產(chǎn)品73份，蔬菜98份，熟肉制品100份。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 50041、大腸桿菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑 培養(yǎng)基，北京陸橋生物技術(shù)有限公司；生化鑒定試劑條，法國(guó)梅里埃公司；沙門氏診斷血清，泰國(guó)A&S公司；藥敏紙片，北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；用于PCR擴(kuò)增的試劑，大連寶生物工程有限公司；擴(kuò)增引物，上海英駿生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 JC303型電熱隔水式培養(yǎng)箱，上海嘉程儀器設(shè)備廠；ATS-032型空氣浴搖床，上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司；BagMixer lab blender 400均質(zhì)器，法國(guó)Interscience公司；基因擴(kuò)增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)，北京炳洋科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品中沙門氏菌的分離鑒定 按照GB 4789.4-2010規(guī)定的方法對(duì)樣品進(jìn)行沙門氏菌的分離與鑒定。試驗(yàn)過(guò)程以沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 50041作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 按照WHO推薦的K-B瓊脂紙片擴(kuò)散法進(jìn)行，結(jié)果判定依照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）2010版方法手冊(cè)進(jìn)行。每批試驗(yàn)均用大腸桿菌ATCC 25922銅綠假單胞菌ATCC 27853進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.3 DNA模板的制備 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IVgyrA、gyrB、parC和parE基因的引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［1］，引物序列見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列雙向測(cè)定。所測(cè)序列采用DNA star軟件進(jìn)行序列拼接和氨基酸序列的推導(dǎo)，并應(yīng)用BLAST軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析比對(duì)。

1.2.5 PCR擴(kuò)增PMQR基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS和aac（6'）-Ib基因的引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［9-11］，引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 食品樣品中沙門氏菌的分離情況

638份樣品中共檢出沙門氏菌62株，總檢出率為9.7%（表2）。367份生肉樣品中檢出沙門氏菌46株，檢出率達(dá)12.5%；73份水產(chǎn)品中檢出沙門氏菌5株，檢出率為6.8%；98份蔬菜樣品中檢出沙門氏菌2株，檢出率為2.0%；100份熟肉制品中檢出沙門氏菌9株，檢出率為9.0%。

2.2 食品樣品中沙門氏菌的血清型分布

62株沙門氏菌中共檢出16個(gè)不同的血清型（表3），其中較為常見(jiàn)的有鴨沙門氏菌（22.6%）、山夫登堡沙門氏菌（17.7%）、德?tīng)柋吧抽T氏菌（12.9%）和腸炎沙門氏菌（8.1%）。

2.3 沙門氏菌對(duì)抗生素的敏感性結(jié)果

本研究中耐藥率為耐藥和中介耐藥的菌株在所有菌株中所占的比例，沙門氏菌對(duì)21種抗生素的敏感性結(jié)果（圖1）表明，62株沙門氏菌對(duì)磺胺甲基異噁唑的耐藥率最高，達(dá)90.3%；其次分別為復(fù)方新諾明（87.1%）、鏈霉素（33.0%）、環(huán)丙沙星（25.8%）、氨芐西林（22.9%）、氯霉素（21.0%）和四環(huán)素（17.7%）。受試菌株對(duì)頭孢噻吩和慶大霉素最敏感，無(wú)耐藥菌株出現(xiàn)。

62株受試菌株中，除4株（6.5%）對(duì)供試的所有抗生素均表現(xiàn)敏感外，其余58株（93.5%）至少對(duì)1種抗生素表現(xiàn)耐藥。對(duì)1-3種抗生素表現(xiàn)耐藥的菌株有33株（53.2%），對(duì)4-6種抗生素表現(xiàn)耐藥的菌株有17株（27.4%），對(duì)7-9種抗生素表現(xiàn)耐藥的菌株有8株（12.9%）。對(duì)3類或3類以上抗生素表現(xiàn)耐藥性的多重耐藥菌株有21株，占試驗(yàn)菌株的33.9%（表4）。在多重耐藥菌株中，德?tīng)柋吧抽T氏菌和腸炎沙門氏菌較為常見(jiàn)。

2.4 沙門氏菌對(duì)抗生素的敏感性結(jié)果

62株沙門氏菌中有16株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，對(duì)這些耐藥菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到gyrA、gyrB、parC和parE基因擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序后檢出由基因突變引起的氨基酸變異結(jié)果（表5）顯示，16株耐環(huán)丙沙星沙門氏菌的GyrA亞基均出現(xiàn)氨基酸突變，11株在ParC亞基發(fā)生突變，而在GyrB和ParE亞基中未檢出突變。

2.5 沙門氏菌中PMQR基因檢測(cè)結(jié)果

62株食源性沙門氏菌中qnr基因陽(yáng)性菌株共7株，占受試菌株的11.3%。qnrA和qnrS基因陽(yáng)性菌株分別有2株和5株，沒(méi)有菌株攜帶qnrB、qnrC和qnrD基因。aac（6'）-Ib基因陽(yáng)性菌株共8株，占受試菌株的12.9%，其中3株經(jīng)確認(rèn)為攜帶其變體基因aac（6'）-Ib-cr。

3 討論

本研究在638份樣品中共檢出62株沙門氏菌，檢出率為9.7%。關(guān)文英等［12］對(duì)河北省3類食品調(diào)查發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌總陽(yáng)性率為20.9%；在楊保偉等［1］對(duì)陜西省零售肉類食品和即食涼拌菜研究中，沙門氏菌檢出率為36.8%。同上述地區(qū)的研究結(jié)果相比，本研究中沙門氏菌檢出率較低。值得注意的是，本次檢測(cè)的生肉類食品中，污染最嚴(yán)重的是牛肉，其次分別為豬肉、羊肉和雞肉，與關(guān)文英等［12］報(bào)道的結(jié)果基本一致。所分離沙門氏菌的血清型主要為鴨沙門氏菌、山夫登堡沙門氏菌、德?tīng)柋吧抽T氏菌和腸炎沙門氏菌，這些被認(rèn)為是引發(fā)多個(gè)國(guó)家和地區(qū)腹瀉型疾病的沙門氏菌血清型，在我國(guó)其他省份和各類食品中也均有檢出［2］。本研究中，沙門氏菌對(duì)除頭孢噻吩和慶大霉素以外的19種抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，其中對(duì)磺胺甲基異噁唑、復(fù)方新諾明、鏈霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率較高，并且有33.9%的菌株呈現(xiàn)多重耐藥。

喹諾酮類藥物的作用靶位為DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV，前者由2個(gè)GyrA亞基和2個(gè)GyrB亞基組成，分別由gyrA和gyrB基因編碼；后者由2個(gè)ParC亞基和2個(gè)ParE亞基組成，分別由parC和parE基因編碼。DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的QRDR發(fā)生氨基酸突變可引起酶的結(jié)構(gòu)與功能改變，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)喹諾酮類耐藥。本研究中的數(shù)據(jù)顯示，16株耐環(huán)丙沙星沙門氏菌按GyrA和ParC的QRDR不同氨基酸替代組合可分為5種突變型，其中GyrA亞基發(fā)生Ser83Phe 和Asp87Gly變異，同時(shí)ParC亞基發(fā)生Ser80Arg變異為最常見(jiàn)的突變類型。本研究中并未發(fā)現(xiàn)只發(fā)生parC突變而gyrA沒(méi)有突變的菌株，與先前的報(bào)道結(jié)果一致［13］，這也說(shuō)明了在喹諾酮耐藥產(chǎn)生的過(guò)程中，只有當(dāng)gyrA突變存在的情況下，parC突變才能發(fā)生并發(fā)揮作用。

PMQR機(jī)制的發(fā)現(xiàn)改變了人們長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為喹諾酮類耐藥僅由染色體介導(dǎo)的觀點(diǎn)。PMQR基因分布較為廣泛，在許多國(guó)家和地區(qū)的腸桿菌科細(xì)菌中均有檢出。除了臨床菌株，從食品動(dòng)物中分離的腸桿菌科細(xì)菌也可檢測(cè)到此類基因。Yue等［14］對(duì)從廣東省家禽和豬中分離的232株大腸桿菌進(jìn)行qnr基因篩查，14株陽(yáng)性菌株中有1株攜帶qnrB，13株攜帶qnrS。Jiang等［15］發(fā)現(xiàn)從養(yǎng)殖魚類中分離的218株大腸桿菌中分別有33株、21株和5株攜帶qnrB、qnrS和qnrD基因。然而關(guān)于PMQR基因在食源性沙門氏菌中的分布卻鮮有報(bào)道。Yang等［13］對(duì)來(lái)自河南省的118株食源性沙門氏菌的研究發(fā)現(xiàn)，qnrA、qnrB、qnrS和aac（6'）-Ib的檢出率分別高達(dá)46.6%、12.7%、19.5%和13.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究的結(jié)果，這可能與地區(qū)差異、菌株數(shù)量有限等因素有關(guān)。

喹諾酮類是合成抗生素，一直被認(rèn)為不受修飾酶的影響。但在2006年初Robicsek等［16］首次報(bào)道了喹諾酮類修飾酶基因aac（6'）-Ib-cr，其本質(zhì)上是一種普通氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac（6'）-Ib的變異體，兩處堿基的突變賦予了其修飾喹諾酮類的特性，兩處變異常同時(shí)存在。本研究對(duì)aac（6'）-Ib的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)有3株菌攜帶其變體基因aac（6'）-Ib-cr。PMQR基因?qū)е碌哪退幰话闶堑退降?，但這并不影響它給臨床帶來(lái)的危害，因?yàn)檫@些耐藥基因的存在有利于使菌株對(duì)喹諾酮類產(chǎn)生高水平的耐藥。PMQR耐藥基因的作用機(jī)制不同于其它的喹諾酮類耐藥機(jī)制，這使得其能夠在不同細(xì)菌中迅速水平傳播而導(dǎo)致更大范圍的流行。同時(shí)，由于PMQR耐藥基因常和其它類型的耐藥基因共同存在于同一個(gè)質(zhì)粒上，往往造成攜帶該質(zhì)粒的菌株表現(xiàn)出多重耐藥。

4 結(jié)論

本研究從食品中分離的62株沙門氏菌對(duì)磺胺甲基異噁唑、復(fù)方新諾明、鏈霉素和環(huán)丙沙星的耐藥率較高，并且有33.9%的菌株呈現(xiàn)多重耐藥。16株耐環(huán)丙沙星的沙門氏菌中GyrA亞基發(fā)生Ser83Phe和Asp87Gly變異，同時(shí)ParC亞基發(fā)生Ser80Arg變異為最常見(jiàn)的突變類型。62株菌中qnr基因陽(yáng)性菌株共有7株，其中qnrA和qnrS基因陽(yáng)性菌株分別有2株和5株。aac（6'）-Ib基因陽(yáng)性菌株共有8株，其中3株經(jīng)確認(rèn)為攜帶其變體基因aac（6'）-Ib-cr。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Study on Antimicrobial Resistance and Plasmid-mediated Quinolone Resistance of Foodborne Salmonella Isolates

Liu Guishen1Yu Tao2
（1. Chaozhou Institute of Measurement and Testing Technology，Chaozhou 521011；2. Xinxiang University，Xinxiang 453000）

A total of 638 food samples were collected randomly to determine the prevalence ofSalmonella.The overall percentage ofSalmonellaprevalence was 9.7%（n=62）. Among 16 different serotypes identified,S. Anatum was most common. The isolates were frequently resistant to sulfamethoxazole, trimethoprim/sulfamethoxazole, streptomycin, and ciprofloxacin. Five different types of amino acid substitutions were identified in quinolone resistance-determining region（QRDR）of GyrA and ParC of 16 ciprofloxacin-resistant isolates. Double mutations of Ser83Phe and Asp87Gly in GyrA accompanied by an additional mutation of Ser80Arg in ParC were found most frequently. Theqnrgenes were present in seven（11.3%）of 62 isolates, and among them, two isolates carriedqnrAand five carriedqnrS.qnrB,qnrC, andqnrDwere not detected in the isolates in this study. Eight isolates were positive foraac（6'）-Ib, of which three isolates carried the-crvariant. The results suggested the diversity of serotype distribution, serious situation of antimicrobial resistance and the presence of plasmid-mediated quinolone resistance（PMQR）genes in foodborneSalmonellafrom Xinxiang.

FoodborneSalmonellaAntimicrobial resistance Plasmid-mediated Quinolone

2014-01-17

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13A610839）

劉貴深，男，高級(jí)工程師，研究方向：產(chǎn)品檢驗(yàn)及質(zhì)量管理；E-mail：suyongyu@126.com

于濤，男，講師，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：yutao7777@hotmail.com