梁昌聰 郭立佳 劉磊 張建華 楊臘英 王國芬 黃俊生

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測與控制重點實驗室，?？?571101）

響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌C101發(fā)酵培養(yǎng)基

梁昌聰 郭立佳 劉磊 張建華 楊臘英 王國芬 黃俊生

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測與控制重點實驗室，?？?571101）

采用響應(yīng)面法對解淀粉芽孢桿菌C101菌株產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。利用Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出影響產(chǎn)孢的3個主要因素：MnSO4、KH2PO4和（NH4）2SO4。在此基礎(chǔ)上運用最陡爬坡路徑法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，最后利用響應(yīng)面分析法確定主要因子之間的交互作用及最佳條件。結(jié)果表明，蔗糖20 g/L，尿素4.0 g/L，豆粕4.0 g/L，KNO32.0 g/L，Na2HPO42.4 g/L，KH2PO40.52 g/L，（NH4）2SO40.55 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，F(xiàn)eSO40.005 0 g/L，MnSO40.005 4 g/L，C101最大理論芽孢含量為14.67×108個/mL。經(jīng)3次平行試驗驗證，實際平均芽孢含量與預(yù)測芽孢含量相近，比之前的芽孢含量提高了188%。

響應(yīng)面法 解淀粉芽孢桿菌 芽孢 優(yōu)化

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌，具有較強(qiáng)的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生能力，能抑制尖孢鐮刀菌［1］等多種植物病原真菌。解淀粉芽孢桿菌C101是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所微生物資源研究與利用課題組從香蕉根際土壤中分離獲得的拮抗鐮刀菌的菌株，對香蕉枯萎病等植物病害有明顯的防治效果（待發(fā)表），應(yīng)用前景廣闊。

目前國內(nèi)外對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵的優(yōu)化主要集中在產(chǎn)抗菌脂肽［2-4］、α-淀粉酶［5］、蛋白酶［6］等酶類物質(zhì)，較少研究解淀粉芽孢桿菌數(shù)量發(fā)酵優(yōu)化；而研究此類菌數(shù)量發(fā)酵優(yōu)化中，多數(shù)研究的目標(biāo)在于提高單位體積發(fā)酵液活菌數(shù)量［7，8］，對提高芽孢數(shù)量研究較少。但從微生物菌劑的保存、使用角度考慮，芽孢數(shù)量較活菌數(shù)量在生產(chǎn)上更具實際意義。

本研究采用Minitab16軟件中的Plackett-Burman設(shè)計法、爬坡路徑法和響應(yīng)面分析方法（Response surface methodology，RSM）相結(jié)合，對前期篩選獲得的一株解淀粉芽孢桿菌C101進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，以提高解淀粉芽孢桿菌C101的芽孢產(chǎn)量為目標(biāo)，旨在為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌C101，從香蕉根際土壤中分離獲得，由本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體種子培養(yǎng)基（NA液體培養(yǎng)基）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，補(bǔ)水至1 000 mL，pH7.0。初始發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20 g，尿素4.0 g，豆粕4.0 g，KNO32.0 g，Na2HPO42.4 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，F(xiàn)eSO40.005 0 g，MnSO40.002 0 g，補(bǔ)水至1 000 mL，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵條件 250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基，初始pH7.0，高壓滅菌20 min。以體積分?jǐn)?shù)為5%接種量轉(zhuǎn)接液體菌種，置于37℃，180 r/min的搖床進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；48 h后對發(fā)酵液中芽孢含量進(jìn)行測定。

1.2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化 通過Minitab16軟件中Plackett-Burman設(shè)計法篩選出對影響芽孢產(chǎn)量的重要因子，再通過爬坡路徑法和響應(yīng)面分析對重要因子的水平進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2.1 Plackett-Burman設(shè)計法 選取培養(yǎng)基的15個（4個空項）組分，以試驗次數(shù)為20的Plackett-Burman設(shè)計法分析發(fā)酵培養(yǎng)基中影響芽孢產(chǎn)量的重要因子。將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的11個組分作為影響因素進(jìn)行全面考察，選擇15因子2水平的試驗設(shè)計，以D、H、L、P為空項以估計試驗誤差，每個因素取高低兩個水平（表1）。

1.2.2.2 爬坡路徑法 根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計的試驗結(jié)果，安排爬坡試驗。以適當(dāng)?shù)奶荻雀淖冎匾绊懸蜃釉诎l(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度，其他組分取低水平即初始發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量濃度，測定發(fā)酵液芽孢量變化趨勢，確定最適質(zhì)量濃度范圍。

1.2.2.3 響應(yīng)面分析 運用Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，以最陡爬坡試驗得到的中心點對Plackett-Burman試驗確定的3個顯著性影響因子各取3水平。設(shè)計了3因素3水平共15個試驗點進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.2.2.4 驗證試驗 用所得到的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行3次平行試驗，取平均值，以驗證模型是否可靠，進(jìn)而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

1.2.3 芽孢計數(shù)方法 將待計數(shù)樣品于80℃水浴處理15 min后，再采用平板菌落計數(shù)法計數(shù)，所得計數(shù)結(jié)果即芽孢數(shù)［9］。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 每個處理包含3個獨立重復(fù)，取3個重復(fù)實驗的平均值。利用 Minitab16軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗和 Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果

2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果分析

通過不同組合觀察發(fā)酵液中芽孢的含量，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。Plackett-Burman設(shè)計的各因素水平及效應(yīng)評價（表3）顯示，從P值大小可以看出，對發(fā)酵液含菌量具有顯著影響的因子依次是O＞F＞J，即MnSO4＞KH2PO4＞（NH4）2SO4，確定這3個因素作為下一步試驗的關(guān)鍵因素。

2.2 最陡爬坡試驗

Plackett-Burman試驗結(jié)果可知，MnSO4、KH2PO4和（NH4）2SO4是影響發(fā)酵液芽孢產(chǎn)量的重要因子，MnSO4是正效應(yīng)因子，應(yīng)依次增大；而KH2PO4、（NH4）2SO4是負(fù)效應(yīng)，應(yīng)依次減小。對3種重要影響因子進(jìn)行爬坡路徑試驗，確定此3種因子的最適質(zhì)量濃度范圍。結(jié)果（表4）顯示，隨MnSO4濃度的增加，KH2PO4、（NH4）2SO4濃度的減少，C101發(fā)酵液芽孢含量的變化趨勢先上升后下降。當(dāng)MnSO40.005 5 g/L、KH2PO40.5 g/L、（NH4）2SO40.5 g/L時，對應(yīng)的發(fā)酵液芽孢含量達(dá)到最大值，為3因子的最大響應(yīng)值區(qū)域，以此為中心點進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果分析

3個重要因子的最適濃度范圍確定之后，以MnSO40.005 5 g/L、KH2PO40.5 g/L、（NH4）2SO4硫酸銨0.5 g/L為中心點實施響應(yīng)面分析，各自變量水平見表5。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，設(shè)計3因子3水平的響應(yīng)面分析試驗，中心點設(shè)置3次重復(fù)，試驗設(shè)計及結(jié)果分析見表6和表7。

該二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2= 0.989 2，表明僅有1.08%的變異不能由此模型解釋；回歸模型P值（prob＞F）=0.000 表明模型是顯著的，失擬項P值為0.896，表明失擬不顯著，模型沒有失擬現(xiàn)象。模型的線性、平方對芽孢數(shù)的影響是顯著的，交互作用對芽孢數(shù)的影響不顯著。經(jīng)回歸擬合后，得到二次多項式方程：Y=-161.408+52212.6X1+45.5311X2+85.6 575X3-4622149X1*X1-44.9895X2*X2-62.9579X3*X3-544.737X1*X2-3815.79X1*X3+7.66667X2*X3

根據(jù)上述擬合回歸方程，通過軟件分析得到相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖和相應(yīng)的等高圖（圖1-圖3）。圖1-A顯示，當(dāng)固定（NH4）2SO40.5 g/L時，KH2PO4從0.2 g/L 增大至 0.6 g/L，MnSO4從0.004 5 g/L 增大至0.006 5 g/L 的過程中，發(fā)酵液芽孢含量均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，曲面的頂點即為芽孢含量最大值點。圖1-B顯示，KH2PO4與MnSO4兩因子交互作用顯著。同理，圖2和圖3中的曲面分別反映了（NH4）2SO4和MnSO4、（NH4）2SO4和KH2PO4的交互作用。

2.4 驗證試驗

利用Minitab16中的響應(yīng)優(yōu)化器解得最優(yōu)值點為MnSO40.005 4 g/L、KH2PO40.52 g/L、（NH4）2SO40.55 g/L時，預(yù)測的最大芽孢數(shù)為14.67×108個/mL。為證實預(yù)測結(jié)果，在該濃度下進(jìn)行重復(fù)搖瓶試驗，重復(fù)3次，結(jié)果分別為15.01×108個/mL、14.65×108個/mL、14.51×108個/mL，平均值為（14.69±0.17）× 108個/mL與預(yù)測值14.67×108個/mL接近，二者的良好擬合性證實了模型的有效性。優(yōu)化后得到解淀粉芽孢桿菌C101菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：蔗糖20 g，尿素4.0 g，豆粕4.0 g，KNO32.0 g，Na2HPO42.4 g，KH2PO40.52 g，（NH4）2SO40.55 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，F(xiàn)eSO40.005 0 g，MnSO40.005 4 g，水1 000 mL。

3 討論

微生物發(fā)酵產(chǎn)品成功實現(xiàn)工業(yè)化的重要環(huán)節(jié)之一是發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。由于Plackett-Burman（PB）設(shè)計法可以從眾多的考察因素中快速、有效的篩選出最為重要的幾個因素［10］，因此廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選。響應(yīng)面分析法（RSM）是用來對受多個變量影響的響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化的一種回歸分析方法，由于所需試驗次數(shù)少、周期短、能確定多種因素間的交互作用，并可通過多元二次回歸方程精確預(yù)測最終產(chǎn)量，已被廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域［11］。目前，利用該方法對不同微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，均不同程度地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。唐志紅等［12］利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化YDX-1菌株的發(fā)酵條件，纖維素酶活性提高了 81.97%。孫力軍等［3，4］用RSM對解淀粉芽孢桿菌ES-2液體發(fā)酵抗菌脂肽的培養(yǎng)基及其主要影響因子進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn) PDB 和 Landy 培養(yǎng)基都是 ES-2 菌株抗菌脂肽產(chǎn)生和積累的較好的培養(yǎng)基?；ㄓ聩i等［13］對 RSM 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，通過優(yōu)化納他霉素產(chǎn)量提高了 32.9%-34.8%。陸繼臣等［14］對RSM優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，表明通過優(yōu)化后，生防菌CNY-04 的OD600較優(yōu)化前提高了 30.9%。這表明，響應(yīng)面分析法是一種科學(xué)、合理的優(yōu)化分析方法。

有效活菌數(shù)是衡量微生物菌劑品質(zhì)的重要指標(biāo)，但是微生菌劑隨著保存時間的延長，活菌數(shù)量不斷減少，有效活菌數(shù)降低，影響微生物制劑的使用效果。芽孢是產(chǎn)芽孢細(xì)菌在生長過程中形成的一種抗逆休眠體，由于芽孢不進(jìn)行新陳代謝活動，能經(jīng)受多種環(huán)境傷害，包括高鹽、高滲、熱、紫外線、多種溶劑、酸、堿等試劑的處理［15］，因此芽孢能延長微生物菌劑的保存期。目前報道的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵的活菌數(shù)可達(dá)109-1010CFU/mL，但均未提及對芽孢數(shù)量的提高，如車曉曦等［8］通過響應(yīng)曲面優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)量的區(qū)間，活菌數(shù)量達(dá)3.0×109CFU/mL，車曉曦等［16］通過優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，活菌數(shù)量達(dá)46×109CFU/mL，張榮勝等［7］通過優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，活菌數(shù)量達(dá)到3.75×109CFU/mL。本研究在最佳培養(yǎng)基組合下，淀粉芽孢桿菌C101實際芽孢含量達(dá)到14.69×108個/mL，與理論最大芽孢含量14.67×108個/mL接近，說明運用響應(yīng)面法優(yōu)化淀粉芽孢桿菌C101液體發(fā)酵芽孢含量是合理可靠的。經(jīng)優(yōu)化，芽孢含量比優(yōu)化前提高了188%。

本試驗通過對解淀粉芽胞桿菌C101發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化為其高產(chǎn)發(fā)酵芽孢工藝奠定了基礎(chǔ)，在實際發(fā)酵過程中該發(fā)酵參數(shù)有待于進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

本研究通過Plackett-Burman設(shè)計，快速有效地從11個影響解淀粉芽孢桿菌C101產(chǎn)芽孢的因素中篩選出3個顯著性影響因素：MnSO4、（NH4）2SO4和KH2PO4，然后利用最陡爬坡法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，并用 Box-Behnken設(shè)計得出最佳培養(yǎng)基組合：蔗糖20 g，尿素4.0 g，豆粕4.0g，KNO32.0 g，Na2HPO42.4 g，KH2PO40.52 g，（NH4）2SO40.55 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，F(xiàn)eSO40.005 0 g，MnSO40.005 4 g，水1 000 mL。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of Fermentation Medium by Bacillus amyloliquefaciens Strain C101 Using Response Surface Methodology

Liang Changcong Guo Lijia Liu Lei Zhang Jianhua Yang Laying Wang Guofen Huang Junsheng
（Environment and Plant Protection Institute，CATAS/ Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops，Ministry of Agriculture/ Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou 571101）

The fermentation medium components for spore content byBacillus amyloliquefaciensstrain C101 was optimized by response surface methodology（RSM）. Firstly, three of the most significant influence factors were screened by the method of Plackett-Burman design as MnSO4, KH2PO4and（NH4）2SO4. The path of steepest ascent was applied to approach the optimal region of the three significant factors. Lastly, the optimal concentration and correlations among three factors were identified by RSM. The optimal fermentation conditions were determined as followed：sucrose 20 g/L, urea 4.0 g/L, soybean meal 4.0 g/L, KNO32.0 g/L, Na2HPO42.4 g/L, KH2PO40.52 g/L, （NH4）2SO40.55 g/L, NaCl 1.0 g/L, MgSO4·7H2O 0.50 g/L, FeSO40.005 0 g/L, MnSO40.005 4 g/L. Under these conditions, the maximum theoretic spore number was 14.67×108/mL. After three parallel verifications, the maximum theoretic value was consistent with mean value of verification test and the spore number was increased by 188% compare to that before optimization.

Response surface methodology（RSM）Bacillus amyloliquefaciensSpore Optimization

2013-11-06

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研項目（200903049）

梁昌聰，男，碩士，助理研究員，研究方向：生物農(nóng)藥；E-mail：lcconghn@163.com

黃俊生，研究員，研究方向：植物保護(hù)和植物病理；E-mail：h888111@126.com