趙旭 王文麗 李娟 呼和

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070）

低溫秸稈降解微生物菌劑的研究進(jìn)展

趙旭 王文麗 李娟 呼和

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070）

秸稈的成分主要有纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等，降解秸稈的微生物包括細(xì)菌、放線菌和真菌。低溫秸稈降解微生物的選育方法有直接從自然界中篩選、誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種等。目前，篩選獲得的低溫秸稈降解菌株的數(shù)量有限，降解秸稈的能力不高，低溫條件下菌株的降解機(jī)理都需要進(jìn)一步的研究。綜述了低溫條件下秸稈降解微生物菌劑的研究進(jìn)展。

低溫降解 作物秸稈 微生物 秸稈還田

農(nóng)作物秸稈是自然界中豐富的可再生資源［1］，截至2009年，我國(guó)農(nóng)作物秸稈可收集資源量達(dá)到6.87×108t，理論資源量達(dá)到8.20×108t，約占世界秸稈總量的20%-30%。秸稈的類型主要有水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈、雜糧秸稈、薯類秸稈、豆類秸稈、棉花秸稈、油菜秸稈和花生秸稈等，其中玉米秸稈占35%，小麥秸稈占21%，稻草占19%［2］，三大作物秸稈占秸稈總量的75%，其他作物秸稈占25%［3］。但由于作物秸稈不能在短時(shí)間內(nèi)被腐解利用，大部分秸稈被直接焚燒，不僅造成資源的浪費(fèi)，還污染了環(huán)境。近年來(lái)，為了充分利用秸稈，經(jīng)過(guò)不斷的研究開發(fā)，形成了秸稈還田作肥料；秸稈氣化、熱解發(fā)電；秸稈粉碎配比作食用菌基料；秸稈青貯、氨化、鹽化作飼料；秸稈加工成型或做編織原料等5條利用途徑［4］。隨著農(nóng)業(yè)技術(shù)的迅猛發(fā)展，秸稈還田越來(lái)越受到重視。作物秸稈原位還田，不僅可以提高秸稈的綜合利用率，而且可以提高土壤肥力、培肥改土。然而我國(guó)北方秋冬季節(jié)氣溫低、冰期長(zhǎng)、凍土層厚、氣候干旱冷涼，秸稈進(jìn)入土壤后，腐解緩慢，還田幾個(gè)月后秸稈變化不大。由于不能及時(shí)腐解，大量秸稈還田后影響農(nóng)田土壤整地和作物的播種，使一些病蟲和病原菌在土壤中長(zhǎng)時(shí)間存活，給作物生長(zhǎng)帶來(lái)嚴(yán)重的危害。如果還田秸稈的大部分在短時(shí)間內(nèi)腐解，不僅不會(huì)影響作物的生根及成活，而且還能提高產(chǎn)量，推廣的意義非常重大。為了提高秸稈降解效率，科學(xué)家們對(duì)秸稈降解微生物

菌劑進(jìn)行了大量研究，并獲得了多種降解秸稈纖維素、木質(zhì)素的菌株，但目前研究獲得的菌株都存在酶活低、穩(wěn)定性差、易退化、特別是耐冷性弱等問(wèn)題，并未顯著提高還田效果，因而選育耐低溫高效降解秸稈的菌株對(duì)進(jìn)一步有效利用農(nóng)作物秸稈具有非常重要的意義。本文系統(tǒng)闡述了國(guó)內(nèi)外有關(guān)低溫秸稈降解微生物的研究進(jìn)展，并展望了今后的發(fā)展趨勢(shì)。

1 秸稈的主要成分及自然降解過(guò)程

1.1 秸稈的主要成分

作物秸稈分莖和葉兩部分，秸稈表面有一層非常致密的角質(zhì)蠟狀膜，這種膜由脂溶性的脂肪醇、脂肪酸、烷烴、酮類、醛類和酯類等有機(jī)分子組成［5］。秸稈表面光滑，蠟質(zhì)層中含有的SiO2和低聚物能防止秸稈在生長(zhǎng)過(guò)程中水分過(guò)度蒸發(fā)和病菌的侵入，但表面蠟質(zhì)層也影響了微生物降解秸稈的速率。秸稈的干物質(zhì)一般由灰分和含氮化合物與非含氮化合物組成。含氮化合物包括蛋白質(zhì)和其他含氮物；非含氮化合物包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等。其中非含氮化合物約占秸稈干重80%。水稻、小麥及玉米等農(nóng)作物秸稈的纖維素含量約為30%-35%，半纖維素含量約為25%-30%，木質(zhì)素含量約為20%-25%［6］。秸稈的碳氮比很高，而微生物生長(zhǎng)對(duì)C/N值的要求在30左右，所以秸稈在自然腐解過(guò)程中將與作物爭(zhēng)奪無(wú)機(jī)氮，腐解效率低，影響作物的生長(zhǎng)。纖維素類物質(zhì)是植物細(xì)胞壁的主要成分，它包括纖維素、半纖維素和三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素等［7］。纖維素是葡萄糖以β-1，4糖苷鍵結(jié)合形成的直鏈高分子化合物，分子式為：（C6H10O5）n，含碳 44.44%、氫6.17%、氧49.39%［8］。纖維素分子主要由結(jié)晶區(qū)（Crystalline）和非結(jié)晶區(qū)（Amorphism）兩部分組成，結(jié)晶度一般在30%-80%之間，結(jié)晶區(qū)分子鏈內(nèi)、鏈間及分子鏈與表面分子之間形成的氫鍵，使纖維素分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定難以被降解，非結(jié)晶區(qū)纖維素結(jié)構(gòu)比較疏松，容易被微生物降解利用［9，10］。常溫條件下，纖維素既不溶于乙醇和乙醚等有機(jī)溶劑，也不溶于稀堿溶液。Petersson 等［11］研究發(fā)現(xiàn)纖維素分子間以及分子內(nèi)存在大量的氫鍵，這給纖維素水解帶來(lái)很大的困難。雖然稀酸不能水解纖維素，但稀酸或纖維素酶等可滲入纖維結(jié)晶區(qū)使纖維素生成D-葡萄糖、寡糖和纖維二糖。

1.2 秸稈的自然降解過(guò)程

作物秸稈的纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素的降解機(jī)理各不相同，因而其降解微生物也存在差異。纖維素的降解是通過(guò)內(nèi)切型葡聚糖酶（Cx酶）、外切型葡聚糖酶（C1酶）和β-葡萄糖苷酶（Cb酶）等協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的［12］。纖維素是通過(guò)酶的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與酶分子連接的，然后利用催化結(jié)構(gòu)水解纖維素。研究者一般只研究其中部分酶的活性，沒有全面了解菌株的降解酶系，存在酶組分比例不協(xié)調(diào)等問(wèn)題［13］。降解纖維素的菌株主要有芽孢桿菌類細(xì)菌、放線菌以及木霉等。尹礎(chǔ)等［14］以纖維素為唯一碳源篩選獲得一株具有秸稈降解功能的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），并研究了其產(chǎn)酶能力。木質(zhì)素的降解機(jī)制非常復(fù)雜，主要有3種酶系組成：木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶。參與降解木質(zhì)素的微生物有細(xì)菌、真菌及相關(guān)微生物菌群，降解的菌株主要有白腐真菌［15］。秸稈的自然降解需要多種酶系在適宜的條件下協(xié)同作用，單菌株由于不能分泌健全的降解酶系，很難達(dá)到對(duì)秸稈的完全降解［12］。宋亞彬等［16］研究了木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系的培養(yǎng)條件，確定了最佳培養(yǎng)碳源、氮源、pH、溫度等。史玉英等［17］研究發(fā)現(xiàn)纖維素分解菌與木質(zhì)素分解菌對(duì)稻草的聯(lián)合分解能力明顯高于單一菌株，所以秸稈降解菌劑的研究逐漸由單菌種的篩選轉(zhuǎn)變?yōu)榫旱暮Y選。

2 秸稈降解微生物的種類

微生物的生命特征多種多樣，生活方式豐富多彩，與自然界中的其他生物相互作用，適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境，代謝方式和生理功能千差萬(wàn)別。利用秸稈降解微生物菌劑處理秸桿，在適宜的溫度和濕度條件下將秸稈中的有機(jī)物質(zhì)礦化、腐殖化，使秸桿中的有機(jī)物、微量元素以及速效N、P、K回歸到土壤中，提高土壤肥力，改善土壤結(jié)構(gòu)，增加作物產(chǎn)量。秸稈降解不同階段發(fā)揮主要作用的微生物各不相同，第一階段主要是細(xì)菌利用秸稈中的可溶性物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖，腐殖質(zhì)開始積累；第二階段主要是真菌降解木質(zhì)素，此階段大量積累腐殖質(zhì)；第三階段主要是放線菌分解腐殖質(zhì)的過(guò)程。

細(xì)菌和真菌主要參加木質(zhì)素的降解，首先是真菌對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行礦化，然后細(xì)菌利用其體積小、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收面大、物質(zhì)交換快等特點(diǎn)，切斷木質(zhì)素的分子鏈，改變木質(zhì)素的性質(zhì)，使其變?yōu)橐捉到獾牡头肿恿烤酆夏举|(zhì)素片段［18］。降解秸稈的細(xì)菌有地衣芽孢桿菌、假單胞桿菌、亮絲桿菌、產(chǎn)堿桿菌、枯草芽孢桿菌等。有學(xué)者利用稀釋平板法篩選出一株耐熱并高效降解秸稈的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌［19］；賀蕓［20］利用分離篩選方法得到一株產(chǎn)胞外耐高溫纖維素酶的細(xì)菌，鑒定為嗜熱脂肪芽孢桿菌。陳麗燕等［21］從腐爛枯枝落葉土壤中分離篩選得到2株產(chǎn)纖維素酶的菌株，分別鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），液體搖瓶培養(yǎng)4 d后，CMC酶活分別可達(dá)163.3 U/mL 和167.17 U/mL。呂明生等［22］從海水和海泥樣品中分離篩選出一株產(chǎn)纖維素酶的菌株，經(jīng)鑒定為交替假單孢菌屬（Pseudoalteromonas sp.），該菌株為革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，有莢膜，無(wú)芽孢，生長(zhǎng)溫度范圍為4-35℃，最適生長(zhǎng)溫度為25℃；最適生長(zhǎng)pH為8.0；最適生長(zhǎng)NaCl濃度為3%。

放線菌生長(zhǎng)繁殖速度緩慢，但其生長(zhǎng)的酸堿范圍和溫差范圍很寬，并可以在惡劣環(huán)境下形成芽孢，適應(yīng)周圍環(huán)境的能力極強(qiáng)，是一類降解秸稈能力較強(qiáng)的微生物。研究表明降解秸桿的放線菌主要有鏈霉菌屬（Streptomyces）、黑紅旋絲放線菌（Actinomyces melaocyclus）、玫瑰色放線菌（Actinomyces roseodiastaticus）、纖維放線菌（Actinomyces cellulosae）、小單胞菌（Micromonospora）等，其降解機(jī)制主要是放線菌可以比較容易的穿透秸稈纖維等不溶基質(zhì)，在中、堿性環(huán)境中增加秸稈的水溶性，促進(jìn)秸稈快速降解。宋波等［23］從草食性動(dòng)物的糞便中篩選得到1株能降解纖維素的菌株，經(jīng)過(guò)鑒定為鏈霉菌屬。周新萍等［24］從朽木中分離得到一株產(chǎn)纖維素酶活力較高的放線菌NC-7，鑒定為生二素鏈霉菌（Streptomyces ambofaciens）。

真菌能分泌胞外酶，且菌絲對(duì)難降解的木質(zhì)素醋質(zhì)層具有機(jī)械穿插作用。因此，真菌對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素有很強(qiáng)的分解作用，是降解秸稈效率最好的微生物菌群，同時(shí)也是目前研究最多的降解秸稈的微生物。20世紀(jì)中葉以來(lái)，科學(xué)家們獲得了大量降解秸稈的真菌，尤以木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、漆斑霉屬（Myrothecium）、毛殼霉屬（Chaetomium）、曲霉屬（Aspergillus）等為主［25-29］。有學(xué)者利用稀釋涂布平板的方法從土壤中分離篩選出 4株降解秸稈能力較強(qiáng)的真菌，鑒定為肉座菌屬的黃曲霉、草酸青霉、木霉和煙曲霉［30］。魏亞琴等［31］從位于蘭州市榆中縣的興隆山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)采集的腐土中分離篩選出一株CMC酶活高達(dá)1 376.2 IU/mL，F(xiàn)PA酶活高達(dá)497.78 IU/mL的菌株，初步鑒定該菌株屬于青霉屬。協(xié)助降解秸稈的酵母菌主要有啤酒酵母、粗球孢子菌和釀酒酵母等。降解秸稈的霉菌主要有青霉、曲霉、木霉、毛殼菌和白腐菌等［32-35］。張明珠等［36］從腐木和土壤中篩選出一株綠色木霉，其CX 酶活達(dá)23.49 U/mL。該菌可使秸稈的纖維素含量降低14%、木質(zhì)素含量降低2.8%。有學(xué)者［37］采用康氏木霉和黑曲霉與乳酸菌共同厭氧發(fā)酵秸稈，結(jié)果顯示，菌群能有效降解秸稈的細(xì)胞壁。

3 低溫秸稈降解微生物的選育方法

低溫環(huán)境是地球表面最豐富的環(huán)境，約占70%。在低溫環(huán)境中存在著很多生物體，特別是細(xì)菌、真菌等微生物。根據(jù)低溫微生物生長(zhǎng)溫度的不同將其劃分為嗜冷菌（Psychrophiles）和耐冷菌（Psychrotrophys）。嗜冷菌的最高生長(zhǎng)溫度為20℃，而耐冷菌能在0℃條件下生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)的上限溫度必須低于40℃。低溫微生物適應(yīng)環(huán)境的能力主要得益于其體內(nèi)的生化反應(yīng)能在低溫下高效進(jìn)行。適應(yīng)低溫的能力包括生物體能夠在低溫下生產(chǎn)和保存適當(dāng)?shù)男玛惔x產(chǎn)物，并且參與代謝的酶在低溫下具有高效的催化活性。低溫環(huán)境下水的黏度會(huì)明顯增大，熱運(yùn)動(dòng)會(huì)顯著降低，酶分子要在這樣的環(huán)境下保持有效的催化效率，必須使結(jié)構(gòu)更加柔韌。已報(bào)道的低溫秸稈降解菌既有嗜冷菌又有耐冷菌，一般最適生長(zhǎng)溫度在10-25℃，多數(shù)不能在超過(guò)37℃的條件下生長(zhǎng)［38］。隨著科學(xué)研究的不斷深入，學(xué)者們?cè)诘蜏亟斩捊到馕⑸镞x育方面也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。最早，科學(xué)家是直接從自然界中人工篩選優(yōu)良的菌種，但是由于自然選育不能滿足人們的生產(chǎn)需要，人們開始運(yùn)用新興的育種方法如誘變育種、原

生質(zhì)體融合育種、基因工程育種等選育菌株。

3.1 從自然界中篩選育種

由于微生物具有適應(yīng)強(qiáng)、易變異的特點(diǎn)，所以在自然界中存在許多具有特殊功能的菌株。早期應(yīng)用在酒精、乳酸、丙酮、丁醇生產(chǎn)中的優(yōu)良菌種，主要是從自然界中篩選獲得的。自然篩選仍然是目前獲得降解秸稈高效菌種的方法之一，如薩如拉等［39］從腐爛的樹葉和高原鋸末中篩選到兩組玉米秸稈降解復(fù)合菌系1號(hào)和8號(hào)。1號(hào)和8號(hào)復(fù)合菌系在玉米秸稈培養(yǎng)基中，15℃培養(yǎng)15 d，玉米秸稈分解率分別達(dá)到30.21%和32.21%。張恒芳等［40］在低溫條件下通過(guò)初篩、復(fù)篩，從腐爛的玉米秸稈垛土壤中分離出2株在低溫條件下降解玉米秸稈能力較強(qiáng)的菌株，處理玉米秸稈10 d，降解率分別達(dá)30.80%和31.52%。直接從自然界中篩選菌株也存在缺點(diǎn)，如自然界中菌株的突變率低，對(duì)目標(biāo)性狀的正突變少，缺乏定向誘變的能力，工作量大，篩選效率低下等，需要新興的育種方法提高選育菌株的效率，為進(jìn)一步開發(fā)利用微生物資源提供技術(shù)支撐。

3.2 原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合是指利用物理、化學(xué)或生物的手段將兩種不同親株的脫壁細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞的原生質(zhì)體合并到一起，使細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生重組交換，獲得兼有雙親性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程。原生質(zhì)體融合育種的優(yōu)勢(shì)在于其可以提高變異的頻率，縮短育種時(shí)間。目前，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育穩(wěn)定高產(chǎn)纖維素酶菌株的研究越來(lái)越多。張新峰等［41］采用紫外線對(duì)嗜熱真菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變處理，成功選育出3株遺傳性能穩(wěn)定的木聚糖酶高產(chǎn)誘變株，木聚糖酶的酶活分別提高了26.5%、37.78%和28.2%。胡婷婷等［42］利用紫外線誘變綠色木霉的原生質(zhì)體，通過(guò)剛果紅透明圈法篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株，其CMC酶活力比綠色木霉原菌提高了124.3%。黑曲霉的β-葡萄糖苷酶活力很高，而里氏木霉外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶活力很高，這樣就可以考慮利用原生質(zhì)體融合技術(shù)把黑曲霉和里氏木霉這兩個(gè)菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，使兩個(gè)菌株實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)性狀互補(bǔ)［43，44］。原生質(zhì)體融合技術(shù)操作復(fù)雜，產(chǎn)生的雜交后代同樣沒有定向性，而且必須有非常簡(jiǎn)便的篩選手段相配合才行。

3.3 物理化學(xué)誘變育種

物理化學(xué)技術(shù)是一種方便快捷的誘變選育優(yōu)良微生物菌種的方法。這種方法可以使菌株的遺傳性狀發(fā)生很大的改變，提高菌株的突變頻率，縮短獲得目的性狀菌株的程序和時(shí)間。常用的化學(xué)誘變劑有亞硝基胍、亞硝酸、硫酸二乙酯等；常用的物理誘變劑有紫外線、60Co-Y射線等。管斌等［45］利用紫外線、亞硝基胍等對(duì)里氏木霉進(jìn)行低劑量、反復(fù)多次復(fù)合誘變處理，以2-脫氧葡萄糖代替葡萄糖作為阻遏物的結(jié)構(gòu)類似物，篩選出一株纖維素酶活力比初始菌株高3倍的菌株。張苓花等［46］對(duì)康氏木霉W-925、J-931用濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線復(fù)合誘變后，得到了一株誘變菌株，其CMC酶活性提高了100%，濾紙?zhí)敲富钚蕴岣吡?1%。劉羽［47］利用紫外燈誘變從南極樣品中分離篩選到能產(chǎn)生低溫高效纖維素酶的菌株 QP7，得到一株具有比較穩(wěn)定的遺傳性的突變菌株QP7-1，它的酶活比出發(fā)菌株提高了24%。還有學(xué)者利用紫外線誘變擬康氏木霉，用具有葡萄糖濃度梯度的雙層平板篩選，獲得1株可以抗產(chǎn)物10%葡萄糖的突變株，該菌株制成干曲后其CMC酶活達(dá)1 145.7 IU/mL；濾紙酶活達(dá)到55.6 IU/mL［48］。陳光等［49］利用快中子對(duì)綠色木霉進(jìn)行福照誘變，研究了不同劑量快中子對(duì)綠色木霉孢子遺傳穩(wěn)定性和致死率的影響。結(jié)果顯示：福照劑量在1.2-4.8 Gy范圍內(nèi)綠色木霉的致死率隨福照劑量的增加而上升，福照劑量為1.2 Gy時(shí)，綠色木霉的致死率達(dá)80%。篩選獲得的突變株的CMC酶活達(dá)914.4 IU/mL，比出發(fā)菌株高30倍，F(xiàn)PA酶活為633.63 IU/mL，比出發(fā)菌株高4倍。物理化學(xué)誘變育種方法對(duì)菌株的致死率較高，并且誘變劑會(huì)污染環(huán)境，突變沒有方向性，篩選鑒定的工作量較大，同樣需要快捷高效的篩選方法配合。

3.4 基因工程育種

隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，學(xué)者們開始利用基因工程手段克隆纖維素酶基因，并將其克隆至多種細(xì)菌和真菌，獲得了高產(chǎn)纖維素酶的工程菌株。Wang等［50］利用致錯(cuò)突變株技術(shù)、易錯(cuò)PCR改造里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶基因eg3，獲得一個(gè)

突變體321T，與出發(fā)菌株相比，其酶的最適pH升高了0.6個(gè)單位。Kim等［51］利用DNA改組技術(shù)改造來(lái)自枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因，獲得了一株CMC酶活力比出發(fā)菌株高2.2倍的工程菌。游銀偉等［52］從黃海海底淤泥中篩選出一株產(chǎn)纖維素酶的適冷革蘭氏陰性桿菌MB1，克隆和分析了MB1 的16S rDNA 序列，經(jīng)鑒定為交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）?？寺≡摼m冷內(nèi)切葡聚糖酶基因celA，并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21 中進(jìn)行了表達(dá)。重組E. coli 菌體破碎后，獲取上清液，其中融合蛋白GST-CelA 濃度約為78.5 mg/L，分析融合酶GST-CelA 的性質(zhì)，為中性適冷酶。熊鵬鈞［53］從深海沉積物樣品中分離到一株具有高內(nèi)切葡聚糖酶活力的細(xì)菌DY3，研究表明DY3在8℃環(huán)境中分泌的胞外酶能水解羧甲基纖維素。設(shè)計(jì)PCR引物從DY3總DNA中擴(kuò)增出一個(gè)約1.5 kb的片段并將該片段克隆到T載體上進(jìn)行測(cè)序。分析表明該片段長(zhǎng)為1 479 bp，是一個(gè)屬于糖基水解酶家族5的纖維素酶基因，命名為celX，利用pET-GST載體，celX基因在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中獲得融合表達(dá)。表達(dá)純化的產(chǎn)物能降解CMC產(chǎn)生纖維二糖和纖維三糖，分解纖維五糖產(chǎn)生纖維二糖和纖維三糖，分解纖維四糖產(chǎn)生纖維二糖。喬宇等［54］利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)入里氏木霉eg2基因，獲得一株能夠高效表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶II的工程菌株Gp2025。利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，內(nèi)切酶活力達(dá)到1 573.0 IU/mL。

4 低溫秸稈降解微生物菌劑的應(yīng)用

秸稈腐熟菌劑是通過(guò)現(xiàn)代生物及化學(xué)技術(shù)生產(chǎn)的微生物活體菌劑，能夠促進(jìn)農(nóng)作物秸稈以及其他有機(jī)物料的腐熟［55］。早期研發(fā)秸稈腐熟劑時(shí)，研究人員主要利用純菌降解秸稈，直到發(fā)現(xiàn)降解效果不理想后才開始進(jìn)行多種菌株組合降解秸稈的研究。隨著研究的不斷深入，通過(guò)菌株淘汰和優(yōu)化組合技術(shù)以及多種微生物之間的協(xié)同關(guān)系，人工篩選多個(gè)菌源，并構(gòu)建產(chǎn)高效纖維素酶的復(fù)合腐熟菌劑，成為了腐熟菌劑研究的熱點(diǎn)［56］。為了達(dá)到腐熟菌劑作用秸稈后不僅不影響下季作物的播種及生長(zhǎng)，還可以增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，人們?cè)诟炀鷦┑母夥€(wěn)定性、腐解效果以及安全性等方面進(jìn)行了大量的研究，以便實(shí)現(xiàn)秸稈的直接還田、解決秸桿再生利用的問(wèn)題［57］。秸稈腐熟菌劑的研究中，以嗜熱的秸稈纖維素、木質(zhì)素分解菌為主，而常溫特別是低溫發(fā)酵分解秸稈纖維素、木質(zhì)素的菌株或菌群的研究較少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。趙明文等［58］研究發(fā)現(xiàn)，接種分解菌群的秸稈廢棄物發(fā)酵34 d后，與不接種的相比，秸稈分解率提高了13.6倍。在接種分解菌群的后75 d，作物的分葉數(shù)增加37.5%、單株干重增加19.77%、次生根增加11.87%；成熟時(shí)，有效穗增加了4.22%、每穗實(shí)粒數(shù)增加了1.72%、干粒重增加了2.08%、實(shí)際產(chǎn)量增加了8.42%。還有學(xué)者［59］研究對(duì)比了5種秸稈腐熟菌劑對(duì)稻稈的腐熟程度及對(duì)晚稻生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，5種腐熟劑都能使土壤中的有機(jī)質(zhì)和各類營(yíng)養(yǎng)成分顯著提高，對(duì)晚稻的增產(chǎn)效果也很顯著，但是5種腐熟菌劑處理間的差異不顯著。丁波等［60］的研究表明，在田間鋪蓋的秸稈上噴灑秸稈腐熟劑后，小麥的增產(chǎn)高達(dá)101.6%-109.9%。秸稈在腐熟時(shí)需嚴(yán)格控制水分，菌劑的均勻程度及對(duì)秸稈的密封等都將影響腐熟的效果。秸稈堆漚還田主要采用厭氧發(fā)酵，這種方法雖然成本低廉，但存在堆漚時(shí)間長(zhǎng)、受環(huán)境影響大的缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步研究獲得能在低溫條件下快速腐解秸稈，并促進(jìn)農(nóng)作物增產(chǎn)的微生物菌劑。

5 展望

秸稈還田不僅可以培肥地力、改善土壤理化性質(zhì)，還能促進(jìn)土壤中有益微生物種群的生長(zhǎng)繁殖，能有效抑制各種病菌的生長(zhǎng)，減少病害的發(fā)生。秸稈降解的關(guān)鍵是微生物技術(shù)的利用，而獲得優(yōu)良的菌株是微生物技術(shù)的核心。我國(guó)北方地區(qū)農(nóng)作物秸稈數(shù)量巨大，但由于秋冬季節(jié)溫度過(guò)低，秸稈還田后不易腐解，影響來(lái)年作物的播種及生長(zhǎng)。在北方地區(qū)的溫度條件下，分離篩選高效降解作物秸稈的菌株，并制備成復(fù)合菌劑，為解決我國(guó)北方地區(qū)作物秸稈的原位還田提供有力的技術(shù)支持，促進(jìn)北方地區(qū)作物秸稈的合理開發(fā)利用，對(duì)解決我國(guó)糧食和資源短缺以及環(huán)境污染都有重大的現(xiàn)實(shí)意義。目前，雖然對(duì)低溫秸稈腐解微生物進(jìn)行了研究，但篩選獲得的低溫秸稈降解菌株數(shù)量有限，降解秸稈的能力

不高，并且低溫條件下降解秸稈主要有哪幾類微生物，秸稈降解不同階段的優(yōu)勢(shì)種群有哪些，分解秸稈的酶在低溫條件下是怎樣發(fā)揮作用的，以及低溫條件下菌落的演替規(guī)律等都需要進(jìn)一步的研究。

［1］段亞冰, 陳洋洋, 康業(yè)斌, 等. F1菌株對(duì)玉米秸稈木質(zhì)素和纖維素降解能力的研究［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009（4）：30-34.

［2］陳紅章. 纖維素生物技術(shù)［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2004.

［3］楊帆, 李榮, 崔勇, 等. 我國(guó)有機(jī)肥料資源利用現(xiàn)狀與發(fā)展建議［J］. 中國(guó)土壤與肥料, 2010（4）：77-82.

［4］管叔琪, 汪建來(lái). 農(nóng)作物秸稈綜合利用的難點(diǎn)與對(duì)策［J］. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 16（3）：21-22.

［5］Kolattukudy PE. Biosynthetic pathyways of cutin and waxes and their sensitivity to environmental stresses［C］// Kerstiens G. Plant cuticles. Oxford：BIOS Scientific Publishers, 1996：83-108.

［6］王建華, 白韻如. 關(guān)于秸稈發(fā)酵飼料研究與開發(fā)若干問(wèn)題的思考［R］. 全國(guó)首屆“生物肥料. ”生物飼料研討會(huì)大會(huì)專題報(bào)告, 1998：10-15.

［7］史央, 蔣愛芹, 戴傳超, 等. 秸稈降解的微生物學(xué)機(jī)理研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)雜志, 2002（1）：47-51.

［8］高潔. 纖維素科學(xué)［M］. 北京：科學(xué)出版社, 1996.

［9］Bayer EA, Lamed R. The cellulose paradox：pollutant par excellence and/or a reclaimable natural resource［J］. Biodegradation, 1992, 3：171-188.

［10］謝占玲, 吳潤(rùn). 纖維素酶的研究進(jìn)展［J］. 草業(yè)科學(xué), 2004（4）：72-76.

［11］Petersson L, Kvien I, Oksman K. Structure and thermal properties of poly（lactic acid）/cellulose whiskers nanocomposite materials［J］. Compos Sci Technol, 2007, 67（11/12）：2535-2544.

［12］劉樹立, 王華, 王春艷, 等. 纖維素酶分子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理的研究進(jìn)展［J］. 食品科技, 2007（7）：12-15.

［13］郭德憲, 曹健, 鮑宇茹. 利用生物技術(shù)降解纖維素的研究進(jìn)展［J］. 鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào), 2001, 22（3）：82-86.

［14］尹礎(chǔ), 夏樂(lè)先, 柳建設(shè), 等. 一株纖維素降解菌株的分離鑒定及產(chǎn)酶特征研究［J］. 環(huán)境技術(shù)與科學(xué), 2009（3）：50-53.

［15］張強(qiáng), 陳合. 玉米秸稈的酶法降解機(jī)理研究［J］. 玉米科學(xué), 2007（5）：148-152.

［16］宋亞彬, 戚桂娜, 鄧偉. 中溫木質(zhì)纖維素降解復(fù)合菌系BYND-8 的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 20（6）：62-67.

［17］史玉英, 沈其榮. 纖維素分解菌群的分離和篩選［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 19（3）：59-62.

［18］管筱武, 張甲耀, 羅宇煊. 木質(zhì)素降解酶及其調(diào)控機(jī)理研究的進(jìn)展［J］. 上海環(huán)境科學(xué), 1998（11）：46-49.

［19］孫軍德, 陳南. 秸稈纖維素降解細(xì)菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究［J］. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010（2）：210-213.

［20］賀蕓. 產(chǎn)胞外耐高溫纖維素酶細(xì)菌的獲得和酶的純化及性質(zhì)研究［J］. 常州工學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 1（19）：13-17.

［21］陳麗燕, 張光祥, 黃春萍. 兩株高產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選、鑒定及酶學(xué)特性［J］. 微生物學(xué)通報(bào), 2011, 38（4）：531-538.

［22］呂明生, 呂鳳霞, 房耀維, 等. 低溫纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究［J］. 食品科學(xué), 2007, 12：235-239.

［23］宋波, 羊鍵. 一株降解纖維素的放線菌的篩選及其產(chǎn)酶條件的研究［J］. 微生物學(xué)雜志, 2005（5）：36-39.

［24］周新萍, 徐爾尼, 汪金萍. 高產(chǎn)纖維素酶生二素鏈霉菌的鑒定與選育研究［J］. 中國(guó)釀造, 2007（3）：20-24.

［25］Tomme P, Van Tilbeurgh H, Pettersson G, et al. Studies of the cellulolytic system of Trichoderma reesei QM 9414［J］. European Journal of Biochemistry, 2004, 170（3）：575-581.

［26］Singh R, Varma AJ, Seeta-Laxman R, et al. Hydrolysis of cellulose derived from steam exploded bagasse by Penicillium cellulases：comparison with commercial cellulose［J］. Bioresource Technology, 2009, 100（24）：6679-6681.

［27］Okunowo WO, Gbenle GO, Osuntoki AA, et al. Production of cellulolytic and xylanolytic enzymes by a phytopathogenic Myrothecium roridum and some avirulent fungal isolates from water hyacinth［J］. African Journal of Biotechnology, 2010, 9（7）：1074-1078.

［28］Geeraerts HAM, Vandamme EJ. Cellulolytic properties of Chaetomium crispatum［J］. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2008, 33（2）：107-113.

［29］Gottschalk LMF, Oliveira RA, Barros RRO, et al. Synergistic enhancement of enzymatic hydrolysis of sugar cane bagasse by Trichoderma and Aspergillus cellulases and xilanases enzyme pools［C］. Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 2009：5-95.

［30］Bailey KL, Lazarovits G. Suppressing soil-borne diseases with residue management and organic amendments［J］. Soil and Tillage Research, 2003（2）：169-180.

［31］魏亞琴, 邵建寧, 麻和平. 纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選和鑒定［J］.食品與機(jī)械, 2011, 5（26）：19-21.

［32］陸師義, 梁枝榮. 食用菌栽培在生態(tài)良性循環(huán)中的意義［J］.生物學(xué)通報(bào), 1989（6）：10-11.

［33］劉娣. 秸稈纖維素高效降解真菌的篩選、鑒定及其纖維素酶基因克隆［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2008.

［34］袁彤光, 張壯塔, 凌德全. 食用菌與植物全纖維素物質(zhì)［J］.食用菌, 1998（1）：4-5.

［35］唐欣昀. 微生物學(xué)［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2009.

［36］張明珠, 張力, 韓大勇. 新型秸稈分解菌的篩選和酶活性研究［J］. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2008（3）：15-17.

［37］Jing DB, Li PJ, Stagnitti F, Xiong XZ. Optimization of laccase production from Trametes versicolor by solid fermentation［J］. Can J Microbiol, 2007, 53：245-251.

［38］Cavicchioli R, Siddiqui KS, Andrews D. Low-temperature expremophiles and their applications［J］. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13：253-261.

［39］薩如拉, 高聚林, 于曉芳, 等. 玉米秸稈低溫降解復(fù)合菌系的篩選［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46（19）：4082-4090.

［40］張恒芳, 李林, 史喜林, 等. 玉米秸稈低溫纖維素分解菌的篩選及分解效果測(cè)定［J］. 玉米科學(xué), 2013, 21（5）：147-150.

［41］張新峰, 張華山, 王偉平, 等. 原生質(zhì)體紫外誘變選育木聚糖酶高產(chǎn)菌株［J］. 中國(guó)釀造, 2010（9）：73-76.

［42］胡停停, 邱雁臨. 原生質(zhì)體紫外誘變選育纖維素酶高產(chǎn)菌株［J］. 化學(xué)與生物工程, 2008（8）：58-60.

［43］陳紅歌, 張東升, 劉亮偉. 纖維素酶菌種選育研究進(jìn)展［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008（8）：5-7.

［44］李雪峰, 侯紅萍. 選育高產(chǎn)纖維素酶菌種的研究進(jìn)展［J］. 酸酒科技, 2010（5）：92-94.

［45］管斌, 孫艷玲. 纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育［J］. 中國(guó)釀造, 2002, 4：18-21.

［46］張苓花, 王運(yùn)吉. 固態(tài)混合發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的研究［J］. 中國(guó)飼料, 1998（2）：14-17.

［47］劉羽. 南極低溫纖維素酶在同步糖化發(fā)酵中應(yīng)用的研究［D］.青島：中國(guó)海洋大學(xué), 2011.

［48］宋小炎, 宋桂經(jīng), 孫彩云, 等. 抗高濃度葡萄糖阻遏的纖維素酶高產(chǎn)菌的選育［J］. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 1999（4）：488-492.

［49］陳光, 徐楊, 孫旸, 等. 快中子輻射誘變對(duì)綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的影響［J］. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 33（2）：177-180.

［50］Wang T, Liu X, Yu Q, et, al. Directed evolution for engineering pH profile of endoglucanase III from Trichoderma reesei［J］. Biomolecular Engineering, 2005（1-3）：89-94.

［51］Kim YS, Jung HC, Pan JG. Bacterial cell surface display of an enzyme library for selective screening of improved cellulose variants［J］. Appl Environ Microbiol, 2000（2）：788-793.

［52］游銀偉, 汪天虹. 適冷海洋細(xì)菌交替假單胞菌（Pseudoalteromonas sp. ）MB-1內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆和表達(dá)［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2005, 45（1）：142-144.

［53］熊鵬鈞. 低溫纖維素酶基因的克隆、表達(dá)和產(chǎn)淀粉酶嗜熱菌的篩選及基因克?。跠］. 廈門：國(guó)家海洋局第三海洋研究所, 2004.

［54］喬宇, 毛愛軍, 何永志, 等. 里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶II基因在畢赤酵母中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］. 菌物學(xué)報(bào), 2004（3）：388-396.

［55］劉甲鋒. 水稻秸稈腐解合菌系的篩選構(gòu)建［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2010.

［56］李文革, 李倩, 賀小香. 枯稈還田研究進(jìn)展［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006（1）：46-48.

［57］張世敏, 汪倫記, 賈新成, 等. 秸稈降解菌制劑的研究初報(bào)［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào), 2001（3）：259-261.

［58］趙明文, 史玉英, 李玉祥, 等. 纖維分解菌群對(duì)水稻秸稈田間腐熟效果的研究［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000（1）：51-53.

［59］楊文兵, 胡正梅, 楊長(zhǎng)斌, 等. 不同秸稈腐熟劑在湖北省晚稻上的應(yīng)用效果試驗(yàn)［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2008（12）：189-193.

［60］丁波, 王義芳, 梅桂芳. 小麥秸稈腐熟劑試驗(yàn)結(jié)果初報(bào)［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)（下半月刊）, 2009（4）：41-82.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advanced in Microbiological Agent of Straw Degradation Under Low Temperature

Zhao Xu Wang Wenli Li Juan Hu He
（Institute of Soil，F(xiàn)ertilizer and Water-saving Agriculture，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070）

The components of straw are cellulose, hemicellulose and lignin. Straw degradation microorganisms including bacteria, actinomyces and fungi. The methods of breeding straw degradation microorganisms include screening from nature, mutation breeding, protoplast fusion breeding, gene engineering breeding and so on. At present, the straw degradation strains under low temperature can be screened few in number, the ability of straw degradation is confined, further study need to be done on the mechanism of low temperature straw degradation. Microbiological agent of straw degradation under low temperature was summarized.

Degradation under low temperature Crop straw Microorganisms Straw return to field

2014-04-14

甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)（2012GAAS15-1）

趙旭，男，碩士，助理研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)微生物，環(huán)境微生物工程；E-mail：zhaoxv6939438@163.com