武建偉 才蕾 王繼華 唐時幸

（廣州萬孚生物技術股份有限公司 自檢型快速診斷國家地方聯(lián)合工程實驗室，廣州 510663）

人D-二聚體的制備及其凍干性質的分析

武建偉 才蕾 王繼華 唐時幸

（廣州萬孚生物技術股份有限公司 自檢型快速診斷國家地方聯(lián)合工程實驗室，廣州 510663）

以人源纖維蛋白原為原材料制備D-二聚體，將其制成凍干品并分析其凍干性質。使用凝血酶、Factor XIIIa酶解纖維蛋白原，獲得交聯(lián)纖維蛋白。經纖溶酶降解交聯(lián)纖維蛋白，生成纖維蛋白降解產物。超濾除去纖維蛋白降解產物中的小分子物質，可獲得較高純度的D-二聚體。通過篩選和優(yōu)化凍干方案，將D-二聚體制備成凍干品。經檢測可知，D-二聚體凍干品可在37℃穩(wěn)定保存12 d；復溶后在25℃穩(wěn)定保存8 d；復溶后在4℃穩(wěn)定保存30 d；復溶時，常用復溶溶劑對其復溶后的活性檢測無明顯影響。

纖維蛋白 纖維蛋白原 D-二聚體 血栓 凍干品

D-二聚體（D-dimer）是交聯(lián)纖維蛋白發(fā)生纖溶的特異性標志物，由纖維蛋白原逐步水解而成［1］。纖維蛋白原是一種具有凝血功能的血漿球蛋白，主要作為凝血因子I參與體內凝血過程［2］。經凝血酶、Factor XIIIa作用，纖維蛋白原被水解成交聯(lián)纖維蛋白；纖溶酶可使纖維蛋白（原）D-E區(qū)互補結構裂解，降解纖維蛋白原和纖維蛋白單體生成纖維蛋白原降解產物，以及降解交聯(lián)纖維蛋白生成纖維蛋白降解產物，纖維蛋白降解產物中含有大量的D-dimer［3，4］。D-dimer分子量約為180 kD［5］，在健康人體內含量極少，一般認定0.5 mg/L（FEU）為cut-off值［6］。另有研究表明，D-dimer的cut-off值與年齡呈正相關，年齡愈大，cut-off值愈高［7］。

機體內凝血和繼發(fā)性纖溶系統(tǒng)的激活，均可使D-dimer水平升高［8］。臨床診斷中，D-dimer檢測常用于：靜脈血栓栓塞（Venous thrombus embolism，VTE）、深靜脈血栓（Deep vein thrombosis，DVT）和肺血栓（Pulmonary embolism，PE）的排除，以及彌漫性血管內凝血（Disseminated intravascular coagulation，DIC）的診斷、溶栓治療的監(jiān)測［9-12］；

急性心肌梗塞（Acute myocardial infarction，AMI）、冠狀動脈缺血（Coronary ischemia）、腦梗塞（Cerebral infarction）［12-14］的診斷和預后判斷；惡性腫瘤，如肺癌（Lung cancer）、卵巢癌、結腸直腸癌（Colorectal cancer）、乳腺癌（Breast cancer）［15-18］，以及肝臟疾?。?9］、糖尿?。?0］、妊娠高血壓綜合征高凝狀態(tài)［21］等的診斷和預后判斷。

真空冷凍干燥（Vacuum Freeze-drying），簡稱“凍干”，是在適宜的真空度下將物質中的水分析出的技術，已廣泛應用于生物制品、醫(yī)藥、食品、花卉產業(yè)、標本制作和古書籍保護等領域［22］。生物制品通過真空冷凍干燥制成凍干品后，具有穩(wěn)定、易復溶等優(yōu)勢，便于保存和運輸。商品化的人源D-dimer蛋白多以液體形式保存于血清中，對保存和運輸條件要求苛刻。以健康新生牛血清作為凍干基質對D-dimer蛋白進行凍干，制備的D-dimer凍干品具有良好的穩(wěn)定性和實用性。

近年來，D-dimer研究多集中于生理意義的剖析和醫(yī)學價值的探討，本研究著重介紹人源D-dimer的制備及其凍干性質的分析。通過逐步酶解和真空冷凍干燥獲得穩(wěn)定高效的D-dimer凍干品，旨在為人源蛋白的制備和保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人源纖維蛋白原、人源凝血酶、人源纖溶酶、抑肽酶、Tris-base購自Sigma公司；人源Factor XIIIa購自AssayPro公司；0.22 μm濾器、Amicon Ultra-15（MWCO：100KDa）購自Millipore公司；健康新生牛血清、PageRuler Unstained High Range Protein Ladder購自Thermo Scientific公司；D-二聚體（D-dimer）定量檢測試劑盒（免疫層析法）為廣州萬孚生物技術股份有限公司（Wondfo）自主研發(fā)；其它試劑均為國產分析純。

蛋白電泳儀、Bio-Rad Gel Doc XR+ 凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；醫(yī)用冷藏箱購自中科美菱公司；AutoRep E 連續(xù)分配器購自RAININ公司；CHRIST ALPHA 1-2/ LD PLUS凍干機購自Martin Christ公司；-86℃立式醫(yī)用低溫保存箱購自SANYO公司。

1.2 方法

1.2.1 D-dimer的制備

1.2.1.1 纖維蛋白原的酶解 稱取適量纖維蛋白原至離心管中，溶入TBS（20 mmol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，2 mmol/L KCl，pH7.4）至終濃度為5 mg/mL，加入凝血酶（終濃度1 U/mL）、Factor XIIIa（終濃度5 μg/mL），37℃水浴4-6 h，即得到白色膠狀交聯(lián)纖維蛋白。

1.2.1.2 交聯(lián)纖維蛋白的洗滌 取出交聯(lián)纖維蛋白至50 mL離心管中，使用TBS顛倒洗滌數(shù)次，放于37℃恒溫搖床中振蕩洗滌約2-3 h。

1.2.1.3 交聯(lián)纖維蛋白的酶解 取出洗滌完畢的交聯(lián)纖維蛋白至干凈的離心管，加入TBS（交聯(lián)纖維蛋白濕重終濃度200 mg/mL）、纖溶酶（終濃度5 mU/mL），37℃水浴至溶液中不再有絮狀交聯(lián)纖維蛋白。向反應體系中加入抑肽酶（終濃度1 μg/mL），充分混勻。

1.2.1.4 D-dimer的超濾 使用0.22 μm無菌濾器將新制的D-dimer溶液過濾至超濾管（MWCO：100KDa）中，超濾濃縮（2 000×g，20 min，4℃）。向濃縮液中加入適量TBS，再次進行超濾濃縮（2 000×g，20 min，4℃），分裝制得的D-dimer濃縮液，保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 D-dimer凍干性質的分析

1.2.2.1 D-dimer的活性檢測與凍干方案的篩選 使用D-二聚體（D-dimer）定量檢測試劑盒（免疫層析法，線性范圍：0.1-10 mg/L）檢測制備的D-dimer活性。為提高D-dimer穩(wěn)定性，將其制成D-dimer凍干品。以3 mL棕色玻璃瓶為容器，每瓶加入500 μL D-dimer凍干工作液。通過調節(jié)真空冷凍干燥時的真空度及凍干時間、凍干稀釋液組份及pH，對凍干方案進行篩選及優(yōu)化。根據(jù)D-dimer凍干品的精密度和系列穩(wěn)定性，選定最佳凍干方案。

1.2.2.2 D-dimer凍干品的穩(wěn)定性分析 為驗證D-dimer凍干品的穩(wěn)定性，使用Wondfo D-二聚體（D-dimer）定量檢測試劑盒監(jiān)測D-dimer凍干品在37℃穩(wěn)定性、復溶后4℃/25℃穩(wěn)定性、不同溶劑復溶凍干品對其活性檢測的影響等。

2 結果

2.1 D-dimer的制備和超濾

將纖維蛋白原酶解體系置于37℃水浴中，白色交聯(lián)纖維蛋白迅速生成，反應體系完全呈膠狀。酶解體系中的交聯(lián)纖維蛋白在37℃水浴中逐漸萎縮，直至完全消失。新制的D-dimer溶液活性遠超出D-二聚體（D-dimer）定量檢測試劑盒的檢測范圍，需適度稀釋后用于定量檢測。經SDS-PAGE凝膠電泳和Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)分析，交聯(lián)纖維蛋白的降解產物中，D-dimer純度約為60%；超濾后，小分子蛋白被大量除去，D-dimer純度升高至90%（圖1）。使用A280nm紫外吸收法檢測D-dimer溶液濃度，發(fā)現(xiàn)D-dimer蛋白總量約為纖維蛋白原的一半，即制備得率約為50%。

圖1 D-dimer的SDS-PAGE凝膠電泳純度分析

2.2 D-dimer的活性檢測與凍干方案的篩選

經過多次摸索和驗證，按照一定的比例將D-dimer蛋白溶液稀釋成位于D-二聚體（D-dimer）定量檢測試劑盒檢測范圍內的3個不同的濃度（高濃度H、中濃度M、低濃度L）。鑒于臨床檢測的D-dimer樣品多以全血或血漿為基質，本研究擬以健康新生牛血清作為D-dimer蛋白的凍干保護劑。凍干前，使用凍干稀釋液（50 mmol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，pH8.0）調節(jié)新生牛血清比例（凍干稀釋液組份及pH經多次正交試驗篩選和優(yōu)化而得，詳細步驟略）。根據(jù)凍干品的系列穩(wěn)定性檢測結果，將凍干保護劑定為12%新生牛血清，真空冷凍干燥真空度：0.025 mbar（Main Drying）/0.012 mbar（Final Drying），凍干時間由凍干樣品的總裝液量而定。凍干后，從每個濃度的凍干品中隨機取出10支進行檢測。稀釋后的D-dimer凍干品活性值均位于檢測試劑的檢測范圍內，3個濃度凍干品的批內精密度（C.V）均小于15%（表1）。

表1 Wondfo試劑檢測D-dimer凍干品均值與精密度

2.3 D-dimer凍干性質的分析

隨機選取D-dimer凍干品用于各項檢測，參考區(qū)間由檢測精密度時的均值而定，即：x-±25%。檢測發(fā)現(xiàn)，D-dimer凍干品可在37℃穩(wěn)定保存12 d（表2），復溶后在4℃穩(wěn)定保存30 d（表3），復溶后在25℃穩(wěn)定保存8 d（表4）。

表2 D-dimer凍干品37℃穩(wěn)定性

檢測不同溶劑復溶凍干品對其活性檢測的影響時，選用去離子水、三蒸水、生理鹽水、瓶裝礦泉水（農夫山泉）和自來水復溶凍干品。經檢測，選用的5種溶劑復溶凍干品時對其活性檢測均無明顯影響（表5）。

3 討論

繼Ruckley等［23］于1970年發(fā)現(xiàn)血清FDP對肺栓塞具有重要的診斷價值之后，Gaffney在FDP中分離得到將近200 kD大小的“γ-γ dimers”，將其命名為 D-dimer，并預言“D-dimer檢測可能會成為有用的診斷依據(jù)”［24-26］。經過多年的研究和臨床驗證，研究人員發(fā)現(xiàn)D-dimer分子量約為180 kD，等電點（pI）為4.9-5.3，在健康人體內的半衰期約為8 h［27］，是交聯(lián)纖維蛋白降解的特異性產物，對多項疾病的診斷具有重要的檢測意義。由于D-dimer不存在疾病特異性，在臨床診斷中，D-dimer以

其高度的敏感性和陰性預示能力時常用于篩查項目和輔助診斷。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布的《Global status report on noncommunicable diseases（2010）》報告稱，心腦血管疾病已成為全球頭號死因，每年死于心腦血管疾病的人數(shù)約占全球死亡人數(shù)的30%［28］。鑒于D-dimer可作為血栓形成性疾病診斷和溶栓藥物療效監(jiān)測的特異性標志物，D-dimer檢測對血栓導致的心腦血管疾病的及早診斷和治療，便顯得尤為重要。

目前，國內多采用進口D-dimer抗原進行相關研究或制備單克隆抗體。進口抗原純度雖高，但價格昂貴，且多以液體形式保存，嚴重制約了D-dimer的研究及其運輸和保存。本研究采用逐步酶解法和超濾即獲得高純度高活性的D-dimer蛋白，并通過真空冷凍干燥將其制成穩(wěn)定的D-dimer凍干品。選用健康新生牛血清為凍干基質，凍干品復溶后幾乎可作為天然D-dimer抗原使用。制備的D-dimer蛋白濃度約為5.6 mg/mL，使用Wondfo D-二聚體（D-dimer）定量檢測試劑盒檢測1 000倍稀釋后的蛋白溶液凍干前的活性約為5.0 mg/L，凍干后的活性約為4.5-5.0 mg/L，檢測時的活性收率和凍干時的活性收率均超過90%。

表3 D-dimer凍干品復溶后4℃穩(wěn)定性

表4 D-dimer凍干品復溶后25℃穩(wěn)定性

表5 不同溶劑復溶D-dimer凍干品對其活性檢測的影響

筆者曾在D-dimer超濾濃縮前，使用HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR（GE）對其進行多次純化，純化效率均不理想。D-dimer經HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR純化后，蛋白純度未能明顯提高，蛋白濃度卻因被稀釋而明顯降低。鑒于超濾后的D-dimer純度約為90%，可滿足D-dimer常規(guī)研究使用，如用作室內質控品/物、陽性對照、免疫或初篩單克隆抗體。

Shackell［29］于1909年使用真空干燥技術將補體、抗毒素、狂犬病毒及其它生物制品進行凍干，制成可以穩(wěn)定保存的凍干品。隨著凍干原理的深入研究和凍干設備的改良，真空冷凍干燥技術現(xiàn)已發(fā)展成為集多門學科于一體的綜合技術工藝。在凍干過程中，預凍過的物料置于真空條件下進行升華干燥，除去冰晶（約占全部水分的90%），升華干燥完成后進入解析干燥，除去未凍結水，至物料中水分含量＜3%［30］。制成的D-dimer凍干品呈多孔餅狀，對溫度、濃度或蛋白酶都具備較高的耐受程度，且易復溶和恢復活性。為使制備的D-dimer凍干品更接近于D-dimer天然抗原，以符合臨床檢測標準，本研究使用新生牛血清作為凍干基質對D-dimer進行凍干。D-dimer凍干品在37℃穩(wěn)定保存12 d；復溶后

在4℃穩(wěn)定保存30 d；復溶后在25℃穩(wěn)定保存8 d；使用常規(guī)溶劑復溶對活性檢測無明顯影響。

4 結論

本研究闡述了一項簡捷高效的人源D-dimer制備方案，以人源纖維蛋白原為原材料，先后經過凝血酶、Factor XIIIa、纖溶酶等酶解和超濾即制得高純度的人源D-dimer蛋白，適于臨床研究的D-dimer凍干品具備較好的穩(wěn)定性。

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（責任編輯 馬鑫）

Preparation and Analysis of Lyophilization Characterization of Human D-dimer

Wu Jianwei Cai Lei Wang Jihua Tang Shixing
（National Engineering Laboratory of Rapid Diagnostic Test， Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd.，Guangzhou 510663）

D-dimer is formed by sequential action of 3 enzymes from fibrinogen. After producing D-dimer, we did the research on its lyophilization process. To produce cross-linked fibrin, fibrinogen was digested by thrombin and Factor XIIa. Then, fibrin degradation products（FDP）was prepared from cross-linked fibrin being degraded by plasmin. D-dimer was purified from FDP through ultrafiltration and prepared into lyophilized powder. By optimizing the lyophilization program, lyophilized D-dimer was stable for at least 12 days at 37℃, stable for at least 8 days at 25℃ and 30 days at 4℃ after reconstitution, and not different when being dissolved by different solvent.The preparation system established in this research is feasible and efficient. Depend on its stability, lyophilized D-dimer could be provided as biological raw materials for further research.

Fibrin Fibrinogen D-dimer Thrombus Lyophilized power

2014-05-12

國家高技術研究發(fā)展計劃（“863”計劃）（2011AA02A103），廣東省戰(zhàn)略新興產業(yè)核心技術攻關項目（2012A080800007）

武建偉，男，碩士，研究方向：免疫診斷；E-mail：Jarviswu@hotmail.com

唐時幸，男，博士，研究方向：免疫診斷；E-mail：tang.shixing@wondfo.com.cn