叢立新，李 蕾，于 錄

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，簡稱金葡菌)是引起化膿性感染的重要人畜共患致病菌，能引發(fā)表皮感染，甚至心內(nèi)膜炎、感染性皮炎、奶牛乳房炎及多種感染性疾病。自1960年首次發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MR-SA)以來，其耐藥性迅速蔓延。細(xì)菌耐藥性成為治療金葡菌感染亟待解決的問題。脊椎動(dòng)物含有豐富的具有血紅素的血紅蛋白，在感染過程中，金葡菌分泌溶血素，導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂而釋放血紅蛋白，優(yōu)先地奪取和使用亞鐵血紅素上的鐵，能夠在體外利用完整的紅細(xì)胞作為唯一的鐵源，有了這些鐵，金葡菌可在宿主體內(nèi)定居并引起發(fā)病[1-2]。一些研究表明，鐵表面調(diào)節(jié)因子IsdA(iron surface adjustment factors A)不僅僅可以與宿主血紅蛋白和血紅素相互作用，還可以粘附許多血清中或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和人類角層細(xì)胞包膜蛋白[3]。此外，IsdA能降低菌體細(xì)胞的疏水性，使它們能夠抵抗人體皮膚脂肪酸和肽的殺菌作用，對金葡菌在人體皮膚上的生存起到關(guān)鍵性作用[4]。本研究通過敲除毒力因子IsdA的編碼基因，阻斷金葡菌的侵襲，為日后金葡菌感染機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為以后抗金葡菌制劑及疫苗的研究開辟了新的途徑。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人角質(zhì)化上皮細(xì)胞Hacat購自ATCC(American Type Culture Collection)，本室常規(guī)傳代。S.aureusNewman購自中國菌種保藏中心。敲除金葡菌野生株 Newman 的 isdA 基因，通過同源重組獲得除 isdA 基因以外相同遺傳背景的突變株與野生株，構(gòu)建NewmanΔIsdA。

1.2主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；胎牛血清購自 HyClone 公司；胰蛋白酶購自 Sigma 公司； Cell Counting Kit-8(CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所； PrimeScript?RT reagent Kit和SYBR?PremixEx Taq(ROXⅡ)購自寶生物工程有限公司(TaKaRa)；DNase I 購自 Fermentas公司； ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Polyvinyliden edifluoride (PVDF)膜購自 Amersham 公司；鼠抗人 Dectin-1 抗體購自 R&D 公司、人源單抗 LL-37 購自Santa cruz 公司、鼠抗人 TLR2 和 TLR4 抗體購自 eBioscience 公司、鼠源單抗 β-actin和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠和羊抗兔IgG購自中杉金橋公司；人IL-8的ELISA檢測試劑盒購自 Biolegend 公司；人 IL-6、TNF-α、MCP-1 的 ELISA 檢測試劑盒購自 eBioscience 公司；彩色預(yù)染蛋白 marker(7-175kDa)購自 NEB 公司。

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，PCR擴(kuò)增儀及梯度擴(kuò)增儀(Biometra)，黑馬凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，垂直板電泳槽、濕法轉(zhuǎn)膜槽及電泳儀(BioRad 公司)，水平搖床(鼎國生物公司)，酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃)，倒置顯微鏡(上海萬衡精密儀器有限公司)，恒溫循環(huán)水浴鍋(日本EYELA)，實(shí)驗(yàn)室碎花冰制冰機(jī)(日本 SANYO)，7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 公司)，化學(xué)發(fā)光呈像系統(tǒng)(DNR 公司)等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1人Hacat上皮細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng) 取出液氮罐中凍存的人Hacat上皮細(xì)胞，立刻置于37 °C的恒溫水浴鍋中，迅速搖動(dòng)，當(dāng)細(xì)胞完全解凍后放入水平離心機(jī)中，1 000 r/min，離心7 min，棄上清，用含有100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、1%丙酮酸鈉、2 mmol/L谷氨酰胺、10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 °C、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，確定生長狀態(tài)良好后使用預(yù)熱的PBS清洗兩遍，更換預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。采用胰酶和EDTA混合的消化法，將狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行傳代。

1.3.2ELISA法檢測Newman及NewmanΔIsdA對上皮細(xì)胞趨化因子和細(xì)胞因子的影響 將人Hacat上皮細(xì)胞按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后換液，每孔加入含有5×106個(gè)細(xì)菌(50倍感染)的新鮮培養(yǎng)基300 μL，相同體積的培養(yǎng)基作空白對照，分別作用3 h、12 h和24 h后收集細(xì)胞上清，8 000 r/min離心20 min，去除沉淀后，吸出上清分別用人IL-8、IL-6、TNF-α和MCP-1的ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子的表達(dá)水平，按照說明書操作。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析Newman及NewmanΔIsdA對上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子、趨化因子、抗菌肽和相關(guān)受體mRNA表達(dá)水平的影響 將人Hacat上皮細(xì)胞按每瓶2×106個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞貼壁后換液，每孔加入含有1×108個(gè)細(xì)菌(50倍感染)的新鮮培養(yǎng)基5mL，相同體積的培養(yǎng)基作空白對照，分別作用3 h、6 h、12 h和24 h后，提取總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。按照PrimeScript?RT reagent Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的人IL-6、IL-8、TNF-a、MCP-1、Dectin-1、LL-37、TLR2、TLR4和β-actin的mRNA基因序列，采用Oligo6生物軟件設(shè)計(jì)Real-time PCR特異引物，并由上海生工合成見表1。

反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；退火階段結(jié)束開始收集熒光，40個(gè)循環(huán)。溶解度曲線程序設(shè)置：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。各個(gè)因子的退火溫度50～60℃之間不等(表2)。

表1 基因、引物序列和擴(kuò)增長度

表2 退火溫度

1.3.4Western blot檢測 將人Hacat上皮細(xì)胞按每瓶2×106個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞貼壁后換液，向細(xì)胞中分別每瓶加入含有1×108個(gè)Newman和NewmanΔIsdA(50倍感染)的新鮮培養(yǎng)基5 mL，設(shè)正常培養(yǎng)的Hacat上皮細(xì)胞為陰性對照，作用3 h。提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)并按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白質(zhì)濃度。將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)及ECL顯色發(fā)光等操作進(jìn)行Western blot檢測。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5[5]統(tǒng)計(jì)軟件以及文獻(xiàn)[6]中2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P< 0.05時(shí)，平均值間差異被記作顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1金葡菌newman IsdA+/-對人Hacat上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌的效果

2.1.1IsdA基因敲除后下調(diào)了Hacat上皮細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-8的表達(dá)水平 如圖1所示，與金葡菌Newman組相比，金葡菌缺失IsdA后，細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-8的分泌水平下降；但與空白未刺激組相比，Newman及NewmanΔIsdA均可以促進(jìn)細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-8(*P<0.05, **P<0.01)的釋放分泌；其中IL-6和IL-8的變化較為明顯，在3～12 h之間抑制最顯著。

2.1.2IsdA基因敲除后抑制了Hacat上皮細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1的分泌 收集金葡菌Newman及NewmanΔIsdA處理組的培養(yǎng)上清，ELISA方法檢測細(xì)胞趨化因子MCP-1的分泌情況。金葡菌缺失IsdA基因后，Hacat上皮細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1的分泌明顯抑制，而在24 h最為明顯。

圖1 IsdA基因缺失后對Hacat細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子分泌的影響

2.2金葡菌Newman IsdA+/-對Hacat細(xì)胞相關(guān)受體及細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的方法，檢測金葡菌 isdA+/-對 hacat 細(xì)胞 TLR2、TLR4、Dectin-1、LL-37 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化和促炎性細(xì)胞因子 IL-6、IL-8 和 TNF-α 以及趨化因子 MCP-1 相應(yīng)的 mRNA 表達(dá)量的變化分析了這7個(gè)基因在 3 h、6 h、12 h 和 24 h 的表達(dá)情況(如圖2-4)。

金葡菌IsdA+/-處理Hacat細(xì)胞后，與對照組相比，促炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)量在剛加入菌液的3 h達(dá)到高峰，隨著時(shí)間的延長而逐漸降低，而缺失IsdA后，3 h到12 h之間表達(dá)水平均明顯下降(*P<0.05, **P<0.01)，IL-6和TNF-α的mRNA在24h變化無明顯差異(P>0.05)，IL-8的表達(dá)水平卻極顯著下降(**P<0.01)。金葡菌IsdA+/-均可使細(xì)胞的MCP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(**P<0.01)，在3 h達(dá)到高峰。IsdA缺失后，3 h～12 h之間其表達(dá)均明顯抑制，并在3 h抑制最明顯；在24 h，IsdA缺失前后MCP-1的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)(圖2)。 TLR2 和 TLR4 表達(dá)量在剛加入菌液的 3h 開始上升，TLR2 在 12h 達(dá)到高峰，隨著時(shí)間的延長而逐漸降低。而在 3h～24h 之間，isdA-組的 TLR2 和 TLR4 的表達(dá)水平明顯低于 isdA+組(*P<0.05，**P<0.01)(圖3)。 Hacat上皮細(xì)胞經(jīng)過金葡菌IsdA+/-作用3～12 h后，與空白對照組相比，明顯上調(diào)了抗炎性細(xì)胞因子Dectin-1和LL-37 mRNA的表達(dá)(*P<0.05,**P<0.01)。IsdA缺失后，3h～12h之間其表達(dá)水平均明顯下調(diào)，并在3 h下降最明顯；而作用24 h后，卻無明顯變化(P>0.05)(圖4)。Hacat細(xì)胞可以自身表達(dá)TLR2、TLR4、Dectin-1、LL-37、IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1，且在3 h～24 h之前的表達(dá)并無明顯差異；進(jìn)行金葡菌處理后，mRNA的轉(zhuǎn)錄水平可以不同程度的升高。而缺失IsdA基因后表達(dá)水平均明顯下調(diào)，個(gè)別因子在24 h無明顯變化，但仍然顯著高于對照組。

2.3Newman及NewmanΔIsdA對上皮細(xì)胞Toll樣受體、Dectin-1和抗菌肽LL-37蛋白水平變化的影響 金黃色葡萄球菌可促進(jìn) Hacat 上皮細(xì)胞 TLR2、TLR4、Dectin-1 和 LL-37 蛋白表達(dá)上調(diào)，TLR2 比 TLR4 上調(diào)明顯；而缺失 IsdA 基因后，這4個(gè)蛋白表達(dá)均下降。

圖2 IsdA基因敲除對Hacat上皮細(xì)胞IL-8I、L-6、TNF-α和MCP-1 mRNA表達(dá)的影響

圖3 IsdA基因缺失對Hacat上皮細(xì)胞表面受體TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)的影響

圖4 IsdA基因缺失對Hacat上皮細(xì)胞Dectin-1與LL37 mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

金葡菌因表達(dá)大量毒力因子而被稱為最具致病力的細(xì)菌之一。金葡菌可引起包括皮膚感染在內(nèi)的一系列感染，嚴(yán)重時(shí)甚至可以威脅人類的生命。角質(zhì)化上皮細(xì)胞作為金葡菌感染的目標(biāo)細(xì)胞，在金葡菌感染的先天免疫和炎癥反應(yīng)中扮演重要的角色，具有炎性介質(zhì)合成和釋放的能力，是宿主皮膚炎癥的積極參與者。人們發(fā)現(xiàn)金葡菌表面蛋白IsdA對細(xì)菌細(xì)胞的表面疏水性的降低可以使它們具有殺菌作用，對人體皮膚上的金葡菌的生存非常必需[7]。因此，本研究選擇了人的角質(zhì)化上皮細(xì)胞Hacat做為細(xì)胞模型，在體外研究了金葡菌IsdA+/-對上皮細(xì)胞活性的影響。

圖5IsdA基因缺失對Hacat上皮細(xì)胞TLR2、TLR4、Dectin-1與LL-37蛋白表達(dá)的影響

Fig.5EffectsofIsdAdeletiononTLR2,TLR4,Dectin-1andLL-37proteinexpressioninHacaTkeratinocytes

哺乳動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)是通過模式識別受體(PRRs)進(jìn)而檢測病原微生物感染。PRRs包括Toll樣受體(TLRs)、Nod樣受體(NLRs)和RIG樣受體(RLRs)三個(gè)家族，TLRs是現(xiàn)在研究比較成熟的受體家族，一些TLRs(TLR2和TLR4)在細(xì)胞表面上表達(dá)，識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)，在天然免疫和獲得性免疫中均有重要作用。最近有研究證明金葡菌細(xì)胞壁上的結(jié)合蛋白具有作為宿主細(xì)胞表面TLR2原始配體的功能。然而該細(xì)胞表面結(jié)合蛋白有效識別TLR2的機(jī)制仍然不清楚；也有證據(jù)表明，TLR2在金葡菌中起著調(diào)節(jié)宿主反應(yīng)的重要作用。事實(shí)上TLR2缺陷型小鼠對金葡菌感染高度敏感[8]。金葡菌可導(dǎo)致皮膚細(xì)胞的TLR2表達(dá)顯著增加，從而提高了皮膚感染癥狀發(fā)展過程中宿主皮膚對細(xì)菌的敏感性。此外，據(jù)報(bào)道，細(xì)菌致膿毒血癥兒童血清細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8水平明顯升高[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相一致：葡萄球菌可以明顯上調(diào)Hacat上皮細(xì)胞的TLR2表達(dá)水平，金葡菌增加炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)，而TLR4的表達(dá)上調(diào)并不顯著。本研究發(fā)現(xiàn)金葡菌作用于上皮細(xì)胞后，可顯著的上調(diào)上皮細(xì)胞模式識別受體TLR2、TLR4、Dectin-1和抗菌肽的表達(dá)，并促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α和趨化因子MCP-1的產(chǎn)生。

IsdA是一個(gè)多功能的表面蛋白，野生型金葡菌誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而導(dǎo)致體內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)，而IsdA基因缺失的金葡菌誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的細(xì)胞因子水平降低，因此我們推測IsdA是金葡菌的重要毒力因子之一。在本實(shí)驗(yàn)中毒力因子IsdA被敲出后的金葡菌與野生株相比，IsdA基因缺失后的金葡菌降低了Hacat上皮細(xì)胞細(xì)胞因子IL-8、TNF-α、IL-6和MCP-1的分泌水平和TLR2、TLR4、Ddectin-1和LL-37的蛋白表達(dá)水平，但高于空白對照組。證實(shí)了IsdA被敲出后的金葡菌的感染力下降，為日后金葡菌病的防治開辟了新的途徑。

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