盧婉青，趙莎莎，蔣松宏，童智子，黃丹妮，郭建華, 2，吳俊偉，周 洋, 2*

(1. 西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2. 西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶 402460)

金黃色葡萄球菌(，簡稱金葡菌)是革蘭陽性菌，廣泛存在于動物皮膚和黏膜以及環(huán)境中，生存能力強(qiáng)，易產(chǎn)生耐藥性，釋放如腸毒素A、α-溶血素、凝集因子A和殺白細(xì)胞素等多種毒素，可引起多種感染性疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致膿毒血癥、敗血癥或肺炎，危及生命。

IFN是宿主防御時生成的細(xì)胞因子，在免疫監(jiān)視和啟動對病原的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。IFN分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，與其受體相互作用后刺激細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控天然免疫和獲得性免疫，觸發(fā)抗感染活性。Ⅰ型IFN最初作為干擾病毒增殖的可溶性因子發(fā)現(xiàn)，由天然免疫細(xì)胞合成。Ⅰ型IFN家族包括多個結(jié)構(gòu)相似的成員，基因存在于人的9號染色體和小鼠的4號染色體， IFN-α主要由白細(xì)胞生成，如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞源自單核細(xì)胞，因此白細(xì)胞稱為天然的IFN生成細(xì)胞，IFN-α稱為白細(xì)胞IFN。IFN-α有13個亞型，研究非常廣泛，其中，IFN-α4直接受IFN調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)調(diào)控，是微生物感染后最早生成的IFN。Ⅰ型IFN的生成受到TANK結(jié)合激酶1(Tank-binding kinase 1，TBK1) /IRF3通路的調(diào)控。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的干擾素基因刺激蛋白(stimulator of IFN genes，STING)識別胞內(nèi)雙鏈DNA，募集并磷酸化TBK1，TBK1激活后與IRF3相互作用，導(dǎo)致IRF3磷酸化和NF-κB通路激活，促進(jìn)Ⅰ型IFN的生成。靜息狀態(tài)下，NF-κB與NF-κB抑制劑α(inhibitor of κBα，IκBα)結(jié)合處于失活狀態(tài)，細(xì)胞受到刺激時，IκBα發(fā)生磷酸化和泛素化，NF-κB與其脫離后激活。金葡菌感染后促進(jìn)樹突狀細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞生成Ⅰ型IFN。金葡菌可入侵豬和人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起腦部感染，如腦膜炎，但該菌感染小膠質(zhì)細(xì)胞后對Ⅰ型IFN通路的影響尚不清楚。本研究表明，金葡菌感染小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2后促進(jìn)IFN-α生成，該過程依賴于TBK1和NF-κB通路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

BV2細(xì)胞和金葡菌由本實驗室保存。

DMEM高糖培養(yǎng)基(C11995500BT)購自Gibco，胎牛血清(P30-3302)購自PAN，胰酶(T8150)和總RNA提取試劑盒(R1200)購自北京索萊寶生物科技有限公司，Mueller-Hinton肉湯(MHB，HB6231)和Mueller-Hinton瓊脂(MHA，HB6232)購自青島海博生物技術(shù)有限公司，化學(xué)發(fā)光液檢測試劑盒(WBKlS0100)購自millipore，BX-795(14932)、IMD-0354(17290)和amlexanox(14181)購自Cayman，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R312)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，小鼠IFN-α ELISA試劑盒(SEKM-0149)購自Thermo Fisher。TBK1(ab235253)、p-TBK1(ab109272)抗體購自Abcam，β-actin(66009)、IκBα(10268)和IRF3(113112)抗體購自proteintech，p-IκBα(AP0614)和p-IRF3(AP0623)抗體購自Abclonal，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZB-2301)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

垂直電泳儀購自Bio-Rad，化學(xué)發(fā)光成像儀購自Vilber。

1.2 細(xì)胞、細(xì)菌培養(yǎng)和感染

BV2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，二氧化碳濃度5%，細(xì)胞匯合度到90%左右時傳代，2 d傳代一次。金葡菌在MHA平板劃線，挑取單克隆接種到MHB 37 ℃過夜培養(yǎng)，50倍稀釋培養(yǎng)2.5 h，12 000 r·min離心2 min，PBS洗滌3次，根據(jù)試驗中指定的MOI加入一定體積的完全培養(yǎng)基，重懸后加入到細(xì)胞中，感染后30 min用37 ℃預(yù)熱PBS洗滌3次，加入含100 μg·mL慶大霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至收樣。

1.3 Western blot

10 μL樣品加入到SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，一抗(TBK1和p-TBK1抗體5 000倍稀釋，其他抗體1000倍稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST(NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Tris base 3 g，Tween-20 1 mL，超純水1 L，鹽酸調(diào)pH7.4)洗滌5次，每次5 min，二抗(10 000倍稀釋)37 ℃孵育1 h，TBST洗滌5次，每次5 min， 滴加化學(xué)發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光。

1.4 實時熒光定量PCR

按照說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，實時熒光定量PCR體系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.4 μL，超純水 8.6 μL。引物序列如表1所示，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。-作為內(nèi)參，相對定量法(2-ΔΔ)分析。IFN-α分別檢測-α4和-αn(包括5個亞型，分別為IFN-α1、α2、α7、α11和α12)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.5 小鼠IFN-α ELISA

細(xì)胞培養(yǎng)液上清1 000 ×離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書檢測IFN-α濃度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

Image pro plus進(jìn)行蛋白灰度分析。試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理，檢驗分析差異，*表示差異顯著(0.01<<0.05),**表示差異極顯著(<0.01)，GraphaPad prism作圖。

2 結(jié) 果

2.1 金葡菌促進(jìn)BV2表達(dá)IFN-α

為探明BV2感染金葡菌后IFN-α表達(dá)水平的變化，首先檢測了金葡菌感染后不同時間點IFN-α的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，感染后1 h，IFN-α轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化，3～6 h轉(zhuǎn)錄水平逐漸上升，12 h降低(圖1A)。分別用MOI為8、40和200的金葡菌感染BV2時，IFN-α的轉(zhuǎn)錄水平上升呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1B)。BV2感染金葡菌后ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-α水平發(fā)現(xiàn)，感染后1～3 h，IFN-α水平?jīng)]有變化，6～12 h釋放進(jìn)入培養(yǎng)液中的IFN-α逐漸上升(圖1C)。BV2感染不同MOI的金葡菌時，IFN-α的釋放量隨著MOI的升高而增加(圖1D)。

NC表示陰性對照；S.A.表示金葡菌；*.0.01

2.2 金葡菌激活BV2 TBK1/IRF3通路

為闡明金葡菌感染BV2細(xì)胞后是否通過該通路誘導(dǎo)IFN-α的生成，首先檢測了1和3的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，BV2感染金葡菌后1～12 h范圍內(nèi)，1和3的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有發(fā)生變化(圖2A、B)。Western blot檢測蛋白水平結(jié)果表明，感染后1～12 h，TBK1和IRF3的蛋白水平?jīng)]有變化，但感染后1 h，TBK1和IRF3磷酸化水平開始升高，在1～6 h逐漸升高，12 h下降，但均高于陰性對照組(圖2C～E)。分別用MOI為8、40和200的金葡菌感染BV2細(xì)胞，6 h后TBK1和IRF3磷酸化水平的升高呈劑量依賴性(圖2F～H)。以上結(jié)果表明，金葡菌感染BV2細(xì)胞后激活TBK1/IRF3通路。

圖2 金葡菌感染BV2細(xì)胞后激活TBK1/IRF3通路Fig.2 S. aureus activates TBK1/IRF3 pathway following infection in BV2 cells

2.3 金葡菌促進(jìn)BV2細(xì)胞生成IFN-α需要TBK1

為探究TBK1在金葡菌誘導(dǎo)BV2細(xì)胞生成IFN-α中的作用，分別用2種TBK1抑制劑BX-795和amlexanox處理細(xì)胞后再感染金葡菌。結(jié)果表明，BX-795抑制TBK1磷酸化后(圖3A和3B)，IRF3蛋白水平?jīng)]有變化，但其磷酸化水平降低(圖3A和3C)，同時，IFN-α釋放量減少(圖3D)。aml-exanox處理BV2后，TBK1磷酸化水平?jīng)]有變化(圖3E和3F)，p-IRF3蛋白水平下降(圖3E和3G)，IFN-α釋放量減少(圖3H)。上述結(jié)果表明，TBK1參與BV2感染金葡菌后生成IFN-α。

A～D. BX-795處理；E～H.Amlexanox處理A-D. Treatment with BX-795; E-H. Treatment with amlexanox圖3 金葡菌誘導(dǎo)BV2細(xì)胞生成IFN-α需要TBK1Fig.3 TBK1 is required for S. aureus-induced IFN-α production in BV2 cells

2.4 金葡菌促進(jìn)BV2細(xì)胞生成IFN-α依賴于NF-κB通路

TBK1激活后介導(dǎo)NF-κB通路活化，促進(jìn)Ⅰ型IFN的生成。為探明BV2細(xì)胞感染金葡菌后生成IFN-α是否依賴于NF-κB通路，首先檢測金葡菌感染后是否激活該通路。BV2感染金葡菌后1～12 h，IκBα蛋白水平?jīng)]有升高，但感染后1 h，p-IκBα蛋白水平開始上升，在1～6 h逐漸升高，12 h略有下降(圖4A、B)。為闡明感染金葡菌后IFN-α生成與NF-κB通路激活的關(guān)系，用IMD-0354處理BV2后感染金葡菌。結(jié)果表明，該抑制劑處理細(xì)胞后，p-IκBα 蛋白水平降低(圖4C、D)，同時伴隨p-TBK1和p-IRF3蛋白水平降低(圖4C、E和F)，并且IFN-α生成減少(圖4G)。以上結(jié)果表明，BV2細(xì)胞感染金葡菌后促進(jìn)IFN-α生成依賴于NF-κB通路。

圖4 金葡菌促進(jìn)BV2細(xì)胞生成IFN-α依賴于NF-κB通路Fig.4 S. aureus-induced IFN-α production is dependent on NF-κB pathway in BV2 cells

3 討 論

巨噬細(xì)胞是細(xì)菌等微生物侵入機(jī)體后機(jī)體防御的第一道防線，在清除病原、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦中常駐巨噬細(xì)胞，起源于骨髓單核細(xì)胞和骨髓造血干細(xì)胞，通過自我更新保持一定數(shù)量，不通過循環(huán)的血祖細(xì)胞分化。BV2細(xì)胞是用攜帶致癌基因v-raf/v-myc的反轉(zhuǎn)錄病毒J2感染原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞獲得的永生化細(xì)胞，常作為替代原代小膠質(zhì)細(xì)胞研究的工具細(xì)胞。金葡菌感染可引起人和動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，如腦膜炎，但金葡菌對小膠質(zhì)細(xì)胞的作用尚沒有報道，因此本研究通過探索BV2細(xì)胞感染金葡菌后Ⅰ型干擾素通路的變化闡明BV2在機(jī)體感染金葡菌后發(fā)揮的機(jī)體防御作用。

Ⅰ型IFN在機(jī)體防御細(xì)菌感染過程中發(fā)揮重要作用。機(jī)體感染嗜肺軍團(tuán)菌、鏈球菌、肺炎雙球菌和大腸桿菌后，Ⅰ型IFN的生成增加，抑制細(xì)菌的增殖，促進(jìn)細(xì)菌從體內(nèi)清除。然而，金葡菌可通過操作宿主的免疫系統(tǒng)促進(jìn)自身的增殖，如自噬和凋亡。金葡菌能入侵吞噬細(xì)胞并利用胞內(nèi)環(huán)境促進(jìn)自身存活和擴(kuò)散。在樹突狀細(xì)胞中，金葡菌通過Toll樣受體9(toll-like receptor 9，TLR9)激活Ⅰ型IFN通路，與野生型小鼠比較，Ⅰ型IFN受體敲除小鼠感染金葡菌后，肺中載菌量下降約20倍，支氣管肺泡灌洗液中載菌量更低，死亡率降低70%。本研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌感染BV2后激活Ⅰ型IFN通路，IFN-α轉(zhuǎn)錄水平和釋放量升高。

TBK1/IRF3通路介導(dǎo)Ⅰ型IFN的生成，TBK1和IRF3通過翻譯后修飾——磷酸化激活。BV2感染金葡菌后1～12 h，TBK1和IRF3在mRNA 和蛋白水平均沒有發(fā)生變化，但感染后1 h發(fā)生磷酸化，IFN-α在感染后3 h mRNA水平升高，6 h釋放量顯著增加，表明金葡菌激活TBK1/IRF3通路介導(dǎo)IFN-α釋放。與此一致的是，TLR4受體激動劑LPS和TLR3受體激動劑poly(I:C)處理小鼠骨髓源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)，或水皰性口炎病毒感染HEK293T細(xì)胞，TBK1和IRF3蛋白水平?jīng)]有變化，但介導(dǎo)其發(fā)生磷酸化促進(jìn)了IFN-α釋放。

TBK1與ATP結(jié)合后促進(jìn)IRF3磷酸化。Amlexanox通過競爭性結(jié)合ATP抑制TBK1活性，但不降低TBK1磷酸化水平，p-IRF3水平下降，是臨床上用于治療癌癥的候選藥物。Amlexanox處理BV2后感染金葡菌，p-TBK1水平?jīng)]有變化，p-IRF3水平降低，IFN-α生成減少，同時，BX-795處理細(xì)胞感染金葡菌后，p-TBK1和p-IRF3水平以及IFN-α生成量均下降，表明TBK1參與金葡菌促進(jìn)BV2細(xì)胞生成IFN-α。

NF-κB在不同微生物激活Ⅰ型干擾素通路中的作用存在差異。一方面，小鼠巨細(xì)胞病毒感染成纖維細(xì)胞后，M35蛋白入核，抑制NF-κB活化，從而減少Ⅰ型干擾素的表達(dá)。從敲除NF-κB相關(guān)蛋白(如RelA、RelB和c-Rel)的小鼠分離的成纖維細(xì)胞感染仙臺病毒或新城疫細(xì)胞，IFN-β的生成下降較少，表明NF-κB在仙臺病毒或新城疫細(xì)胞誘導(dǎo)I型干擾素生成中的作用較小。另一方面，甲型流感病毒激活NF-κB，促進(jìn)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)表達(dá)，抑制Ⅰ型干擾素表達(dá)。β-聯(lián)蛋白(β-catenin)與p300轉(zhuǎn)錄輔因子互作，結(jié)合IFN-β啟動子，促進(jìn)IFN-β表達(dá)，甲型流感病毒通過激活NF-κB抑制過表達(dá)β-聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)水平升高。本研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌誘導(dǎo)BV2細(xì)胞生成IFN-α需要NF-κB的參與。

4 結(jié) 論

BV2細(xì)胞感染金葡菌后，激活TBK1/IRF3和NF-κB通路，促進(jìn)IFN-α的生成。