羅　妍，王　遷

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol，2014，8(3)：248- 253

系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis，SSc)是一種以皮膚及多系統(tǒng)炎性纖維化、小血管病變?yōu)橹饕卣鞯淖陨砻庖呒膊?。其發(fā)病機(jī)制不清。目前認(rèn)為，包括血管病變、炎性反應(yīng)、纖維化及自身免疫4大機(jī)制相互作用。血管病變可能是始動(dòng)因素，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或功能紊亂，毛細(xì)血管舒縮功能、通透性改變，之后血栓形成、炎性反應(yīng)激活，最終導(dǎo)致血管閉塞、組織缺血缺氧。炎性反應(yīng)發(fā)生于疾病早期，皮膚病變以CD4+T細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤為主，而肺部病變處則以CD8+T細(xì)胞為主，二者可能發(fā)病機(jī)制不完全相同?；颊哐灏l(fā)現(xiàn)多種自身抗體，其中最具有標(biāo)志性的是抗DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抗體(抗Scl-70抗體)及抗著絲點(diǎn)抗體。處于核心地位的纖維化主要由血管病變和炎性反應(yīng)起始，多種生長因子、趨化因子參與調(diào)控，轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)β通路主要參與，最終促進(jìn)纖維化過程[1]。

對SSc發(fā)病機(jī)制的了解有助于及早診斷和探索更有效的治療手段，因此能夠模擬疾病的動(dòng)物模型起到不可或缺的作用。目前，已有多種模擬SSc的動(dòng)物模型，但無一種能完美代表這種疾病，不同的研究目的需選擇不同的動(dòng)物模型，本文將就目前常用的SSc動(dòng)物模型的建模方法、模擬性及應(yīng)用方面進(jìn)行綜述，希望能為研究者選擇正確的、合適的動(dòng)物模型提供幫助。

動(dòng)物模型分類

SSc的動(dòng)物模型從建模方法上可以分為兩大類，即誘導(dǎo)模型和基因模型。前者主要包括博來霉素誘導(dǎo)小鼠模型、慢性硬皮病樣移植物抗宿主病模型及活性氧簇活性氧離子(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)模型；后者則又分為突變模型及轉(zhuǎn)基因模型，突變模型主要包括緊皮鼠(tight skin mouse，TSK)模型和UCD200206小雞模型，轉(zhuǎn)基因模型則包括Fra-2、TBRICA； Cre-ER、TβRIIΔk、Caveolin-1模型等。前文簡述了SSc的4大基本特點(diǎn)，故將主要從這些方面將模型與SSc患者進(jìn)行比較(表1)。

表1　常見動(dòng)物模型主要特點(diǎn)

誘導(dǎo)模型

博來霉素誘導(dǎo)小鼠模型：該是目前應(yīng)用最廣泛的一種硬皮病動(dòng)物模型，它可模擬硬皮病早期炎性反應(yīng)階段[2]。早期常用博來霉素給小鼠氣管內(nèi)灌注或吸入建立肺纖維化的動(dòng)物模型[3]，后發(fā)現(xiàn)皮下注射數(shù)周后可出現(xiàn)注射局部皮膚纖維化、肺纖維化及血清抗體陽性等SSc表現(xiàn)[3-5]。不同品系小鼠敏感性不同，BALBc小鼠相對耐藥，而C3HHe、B10.A等更加敏感[5]。該模型小鼠纖維化部位可見膠原沉積、TGFβ1轉(zhuǎn)錄增加、肌成纖維細(xì)胞分化激活，并伴以巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及漿細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤[6]，輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)2反應(yīng)相關(guān)因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 4、IL-13水平升高[5，7]。小鼠血清抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)(+)，包括抗Scl-70抗體、抗CENP B抗體、抗U1RNP抗體、抗組蛋白抗體、抗雙鏈DNA抗體等[7]。該模型總體毛細(xì)血管含量增加不符合SSc患者特點(diǎn)，也未見硬皮病特征性的中小動(dòng)脈閉塞性血管病[3]。其發(fā)病機(jī)制可能由活性氧簇ROS介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)，最終激活成纖維細(xì)胞及TGFβ通路，引起纖維化[7](圖1)。

博來霉素誘導(dǎo)小鼠模型廣泛應(yīng)用于SSc發(fā)病機(jī)制研究及新藥治療效果觀察。目前研究以基因?qū)用妗⒌鞍踪|(zhì)水平、細(xì)胞水平較多，發(fā)病機(jī)制方面與免疫炎性反應(yīng)有關(guān)的靶點(diǎn)包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、炎性細(xì)胞與成纖維細(xì)胞間的相互作用以及相關(guān)細(xì)胞因子如IL-6[8]、IL-17[9]、IL-33[10]、TNF-α[11]等，纖維化通路靶點(diǎn)則從經(jīng)典的TGFβSmad通路[7]、Wnt通路[12]中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的各種蛋白，到新發(fā)現(xiàn)的TGFβ非Smad通路[7]、黏附分子[13]以及某些激素等[14]。轉(zhuǎn)錄翻譯的調(diào)控層面例如表觀遺傳學(xué)、miRNA的研究相對較少。治療探索方面，與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的有過氧化物酶體增生物激活受體[15]、酪氨酸激酶[16]、TGFβSmad通路，其他還有N-乙酰半胱氨酸[17]、雷帕霉素[18]、沙利度胺[19]等，甚至干細(xì)胞治療[20]、皮膚光照治療PUVA[21]等。但該模型炎性反應(yīng)過重且非炎性反應(yīng)的后期階段表現(xiàn)相對較弱，某些情況下尤其是治療學(xué)研究方面必須與非炎性模型聯(lián)合應(yīng)用[2]。另外由于幾乎不能模擬血管病變，故在血管病變的研究受到限制。

慢性硬皮病樣移植物抗宿主病模型：慢性硬皮病樣移植物抗宿主病模型(chronic sclerodermatous GVHD model)，以下簡稱Scl-GVHD模型，也是一種以炎性表現(xiàn)為特點(diǎn)的動(dòng)物模型。該模型的建立基于進(jìn)行過異體造血干細(xì)胞移植的長期生存者中約40-60%會(huì)出現(xiàn)自身免疫病表現(xiàn)的慢性移植物抗宿主病[3]。1983年Jaffee等將B10.D2小鼠的脛骨、股骨骨髓及脾制成淋巴細(xì)胞懸液移植入接受亞致死劑量照射過的BALBc小鼠體內(nèi)，3周左右受體小鼠出現(xiàn)全身多器官纖維化[22]。如將受體換成固有免疫缺陷的RAG-2小鼠可降低死亡率，其肺纖維化相對較輕而皮膚纖維化更嚴(yán)重[23]。標(biāo)準(zhǔn)Scl-GVHD模型在移植后3周左右出現(xiàn)肺、皮膚、肝、腎、胃腸道、腮腺等多器官纖維化，在纖維化出現(xiàn)之前1周病灶處有以單核細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，且這些細(xì)胞為供體來源[3]。小鼠血清ANA(+)但種類不明。其機(jī)制尚不明，目前認(rèn)為小鼠血清及組織中趨化因子升高可能參與炎性反應(yīng)及纖維化。Scl-GVHD因移植技術(shù)比較復(fù)雜而應(yīng)用受到一定限制，且移植后動(dòng)物處于免疫抑制易發(fā)生感染而死亡，故應(yīng)用相對較少[3]。

圖1　博來霉素誘導(dǎo)模型機(jī)制Fig 1　Mechanism of bleomycin-induced model　　　ECM：細(xì)胞外基質(zhì)

ROS介導(dǎo)的動(dòng)物模型：既往研究發(fā)現(xiàn)，SSc患者的成纖維細(xì)胞可自發(fā)產(chǎn)生大量活性氧簇ROS，可促進(jìn)膠原合成[7]，在此基礎(chǔ)上2009年建立了ROS介導(dǎo)的小鼠模型。給小鼠皮下注射過氧亞硝酸鹽(ONOO-)可引起注射部位限制性皮膚損害以及血清抗CENP B抗體陽性；如皮下注射次氯酸(OH·HOCl)持續(xù)6周則可引起小鼠皮下及肺纖維化、腎損害以及血清抗Scl-70抗體(+)。這兩種試劑注入體內(nèi)后均可產(chǎn)生ROS。該模型病灶局部有T細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，早期可見到血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞[7，24]。該模型由于建立時(shí)間較短而應(yīng)用不多。研究者利用該模型發(fā)現(xiàn)SSc皮膚及肺部纖維化發(fā)病機(jī)制不同的可能機(jī)理，皮膚原位為成纖維細(xì)胞內(nèi)形成ROS直接激活Ras通路，而ROS可氧化的蛋白可入循環(huán)誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生，并到遠(yuǎn)隔臟器引起炎性及纖維化。在該模型中首次證實(shí)抗Scl-70抗體直接參與致病(圖2)。

基因突變模型

TSK模型：TSK模型包括TSK-1及TSK-2，其基因突變位點(diǎn)不同但表現(xiàn)相似。B10.D2(58N)Sn近交系小鼠2號染色體原纖維蛋白基因1(fibrillin gene 1，F(xiàn)bn-1)發(fā)生顯性突變，純合體在胚胎階段死亡，雜合體就是TSK-1小鼠模型，該基因可編碼細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白原纖維蛋白，故該模型的最顯著特點(diǎn)是纖維化[25]。TSK-1小鼠具有皮膚和肺纖維化，但其病理特點(diǎn)與SSc患者并不完全相符合：小鼠皮膚纖維化發(fā)生于皮下、較深，筋膜層、肌層等受累，而SSc患者皮膚纖維化部位多位于真皮內(nèi)；小鼠肺部受累以肺氣腫為主要表現(xiàn)，在SSc患者中無此特點(diǎn)[26]。TSK-1小鼠皮膚病灶處無炎性細(xì)胞浸潤的證據(jù)，故為非炎性模型的代表。未見小鼠發(fā)生內(nèi)皮凋亡、小動(dòng)脈閉塞等其他血管病變。該模型血清ANA升高，鑒定出的類型有抗Scl-70抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗RNA聚合酶Ⅰ抗體等[3]。TSK-1模型常與博來霉素誘導(dǎo)模型聯(lián)合應(yīng)用，后者主要模擬早期炎性階段，而該模型主要用于模擬纖維化階段。就目前已發(fā)表的研究來看，該模型的獨(dú)特之處在于發(fā)現(xiàn)明確的B細(xì)胞活化，故較多應(yīng)用于B細(xì)胞如何參與發(fā)病機(jī)制以及以B細(xì)胞為目標(biāo)的治療探索。但該模型纖維化病變與系統(tǒng)性硬化患者不完全相符合，應(yīng)用受到一定限制。TSK-2小鼠為101H小鼠由致突變劑乙基亞硝基誘變后的子代，亦為常染色體顯性突變，尚未確定責(zé)任基因。該模型與TSK-1相比具有以單核細(xì)胞浸潤為主的炎性反應(yīng)，其余表現(xiàn)類似，比TSK-1在模擬性方面更加全面[27]。目前因機(jī)制不清，應(yīng)用較少。

轉(zhuǎn)基因模型

轉(zhuǎn)基因模型由于依賴較為復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，并且靶點(diǎn)單一、無法模擬疾病全貌，故應(yīng)用相對不是特別廣泛，在這里對一些模型做簡要介紹。

Fra-2是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白(activator protein-1， AP-1)家族成員，參與應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡、炎性反應(yīng)、損傷修復(fù)、癌變等許多生命基本過程。2008年偶然在由H2KB啟動(dòng)子介導(dǎo)的Fra-2過表達(dá)小鼠中觀察到肺纖維化[30]，后又發(fā)現(xiàn)其具有微血管內(nèi)皮凋亡、皮膚毛細(xì)血管減少、肺動(dòng)脈高壓等血管病變[31]。肺動(dòng)脈高壓會(huì)使小鼠壽命極大降低，影響其應(yīng)用。由于目前只有極少數(shù)模型能夠模擬系統(tǒng)性硬化的血管病變，尤其是SSc相關(guān)肺動(dòng)脈高壓，故在未來的研究中具有一定的意義[2-3]。

TGFβ通路是纖維化中一條非常重要的通路，因此通過持續(xù)激活該通路可能創(chuàng)造新的纖維化模型。如TBRICA； Cre-ER轉(zhuǎn)基因小鼠是在TGFβRI基因的上游引入增強(qiáng)子和他莫昔芬誘導(dǎo)Crelox P系統(tǒng)，小鼠出生后通過注射他莫昔芬來持續(xù)性激活成纖維細(xì)胞內(nèi)TGFβRI表達(dá)[32]。小鼠出現(xiàn)皮膚纖維化，不會(huì)自發(fā)出現(xiàn)肺纖維化，但對博來霉素比普通小鼠更加敏感。病灶無明顯炎性浸潤，無典型血管病變，血清未見自身抗體。另一種TβRIIΔk轉(zhuǎn)基因小鼠的目標(biāo)基因是一種激酶有缺陷的突變TGFβRII，突變后該受體可結(jié)合胞外游離的TGFβ，但隨后不能磷酸化TGFβRI并進(jìn)一步起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得體內(nèi)TGFβ代償性上調(diào)，TGFβ通路被激活[33]。這種小鼠在生后6周出現(xiàn)肺纖維化，12周時(shí)約25%的小鼠出現(xiàn)皮膚纖維化，另外部分還可出現(xiàn)纖維性心肌病[3]。這些模型也主要應(yīng)用于TGFβ通路介導(dǎo)的纖維化的研究。

Caveolin-1是一種特異性脂筏，可介導(dǎo)TGFβ受體內(nèi)化而使下調(diào)TGFβ通路，該蛋白敲除的小鼠以纖維化病變和血管病變?yōu)橹鱗34]。小鼠可出現(xiàn)肺部和皮膚纖維化，其肺部臨床類似于放射性肺炎，病理表現(xiàn)為肺泡間隔細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積。小鼠微血管病變表現(xiàn)為血管因內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂引起張力異常、通透性增加，大小動(dòng)脈均可受累，并可出現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓。該模型機(jī)制比較復(fù)雜，因?yàn)镃aveolin-1作為脂筏可引起除TGFβR之外的其他受體內(nèi)化而影響其他多個(gè)通路。但模型本身卻為SSc的治療提供一種思路，即通過外源引入Caveolin-1來促進(jìn)TGFβ通路下調(diào)從而抑制纖維化[35]。

總　　結(jié)

SSc的動(dòng)物模型中，能夠模擬早期炎性階段的主要模型為博來霉素誘導(dǎo)模型、慢性硬皮病樣GVHD模型，以纖維化為主要特點(diǎn)的模型有TSK模型、各種以TGFβ通路為靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因模型等，而進(jìn)行微血管病變的相關(guān)研究則主要利用突變模型UCD200小雞以及轉(zhuǎn)基因模型Fra-2小鼠。在這些所有模型中，沒有一種能夠完美模擬人類的SSc，所以在選擇合適的動(dòng)物模型前應(yīng)當(dāng)明確自己的研究目的，廣泛了解各種模型的特點(diǎn)，以便于選擇最合適的研究模型，獲得最有意義的結(jié)果。

(本文圖2見封三)

[1]Kelley WN. Kelley’s textbook of rheumatology[M].Elsevier Health Sciences， 2012.

[2]李夢濤，侯勇，雷云霞，等. 合作與發(fā)展:系統(tǒng)性硬化癥的未來--第一屆國際系統(tǒng)性硬化癥會(huì)議紀(jì)要[J]. 中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志, 2010, 4:151-154.

[3]Aso Y， Yoneda K， Kikkawa Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice[J].Lab Invest， 1976， 35：558-568.

[4]Yamamoto T， Takagawa S， Katayama I， et al. Animal model of sclerotic skin. I：Local injections of bleomycin induce sclerotic skin mimicking scleroderma[J].J Investigative Dermatol， 1999， 112：456- 462.

[5]Yamamoto T， Kuroda M， Nishioka K. Animal model of sclerotic skin. III：Histopathological comparison of bleomycin-induced scleroderma in various mice strains[J].Arch Dermatol Res， 2000， 292：535-541.

[6]Batteux F， Kavian N， Servettaz A. New insights on chemically induced animal models of systemic sclerosis[J].Curr Opin Rheumatol， 2011， 23：511-518.

[7]Yoshizaki A， Iwata Y， Komura K， et al. CD19 regulates skin and lung fibrosis via Toll-like receptor signaling in a model of bleomycin-induced scleroderma[J].Am J Pathol， 2008， 172：1650-1663.

[8]Kitaba S， Murota H， Terao M， et al. Blockade of interleukin-6 receptor alleviates disease in mouse model of scleroderma[J].Am J Pathol， 2012， 180：165-176.

[9]Okamoto Y， Hasegawa M， Matsushita T， et al. Potential roles of interleukin-17A in the development of skin fibrosis in mice[J].Arthritis Rheum， 2012， 64：3726-3735.

[10] Luzina IG， Kopach P， Lockatell V， et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury[J].Am J Respir Cell Mol Biol， 2013， 49：999-1008.

[11] Murota H， Hamasaki Y， Nakashima T， et al. Disruption of tumor necrosis factor receptor p55 impairs collagen turnover in experimentally induced sclerodermic skin fibroblasts[J].Arthritis Rheum， 2003， 48：1117-1125.

[12] Beyer C， Reichert H， Akan H， et al. Blockade of canonical Wnt signalling ameliorates experimental dermal fibrosis[J].Ann Rheum Dis， 2013， 72：1255-1258.

[13] Yoshizaki A， Yanaba K， Iwata Y， et al. Cell adhesion molecules regulate fibrotic process via Th1Th2Th17 cell balance in a bleomycin-induced scleroderma model[J].J Immunol， 2010， 185：2502-2515.

[14] Kokot A， Sindrilaru A， Schiller M， et al. α-melanocyte-stimulating hormone suppresses bleomycin-induced collagen synthesis and reduces tissue fibrosis in a mouse model of scleroderma：Melanocortin peptides as a novel treatment strategy for scleroderma?[J].Arthritis Rheum， 2009， 60：592-603.

[15] Wu M， Melichian DS， Chang E， et al. Rosiglitazone abrogates bleomycin-induced scleroderma and blocks profibrotic responses through peroxisome proliferator-activated receptor-γ[J].Am J Pathol， 2009， 174：519-533.

[16] Iwamoto N， Distler JHW， Distler O. Tyrosine kinase inhibitors in the treatment of systemic sclerosis：from animal models to clinical trials[J].Curr Rheumatol Rep， 2011， 13：21-27.

[17] Zhou CF， Yu JF， Zhang JX， et al. N-acetylcysteine attenuates subcutaneous administration of bleomycin-induced skin fibrosis and oxidative stress in a mouse model of scleroderma[J].Clin Exp Dermatol， 2013， 38：403- 409.

[18] Yoshizaki A， Yanaba K， Yoshizaki A， et al. Treatment with rapamycin prevents fibrosis in tight-skin and bleomycin-induced mouse models of systemic sclerosis[J].Arthritis Rheum， 2010， 62：2476-2487.

[19] Zhao L， Xiao K， Wang H， et al. Thalidomide has a therapeutic effect on interstitial lung fibrosis：evidence from in vitro and in vivo studies[J].Clin Exp Immunol， 2009， 157：310-315.

[20] Azhdari M， Baghaban-Eslaminejad M， Baharvand H， et al. Therapeutic potential of human-induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells in a bleomycin-induced scleroderma mouse model[J].Stem Cell Res， 2013， 10：288-300.

[21] Hayashi S， Ikeda M， Kitamura Y， et al. UVA irradiation following treatment with topical 8-methoxypsoralen improves bleomycin-induced scleroderma in a mouse model， by reducing the collagen content and collagen gene expression levels in the skin[J].J Dermatol Sci， 2012， 67：20-25.

[22] Jaffee BD， Claman HN. Chronic graft-versus-host disease (GVHD) as a model for scleroderma：I. Description of model systems[J].Cell Immunol， 1983， 77：1-12.

[23] Ruzek MC， Jha S， Ledbetter S， et al. A modified model of graft-versus-host-induced systemic sclerosis (scleroderma) exhibits all major aspects of the human disease[J].Arthritis Rheum， 2004， 50：1319-1331.

[24] Servettaz A， Goulvestre C， Kavian N， et al. Selective oxidation of DNA topoisomerase 1 induces systemic sclerosis in the mouse[J].J Immunol， 2009， 182：5855-5864.

[25] Siracusa LD， McGrath R， Ma Q， et al. A tandem duplication within the fibrillin 1 gene is associated with the mouse tight skin mutation[J].Genome Res， 1996， 6：300-313.

[26] Denton CP， Lafyatis R. Overview of animal models[M]Scleroderma. Springer US， 2012：291-307.

[27] Christner PJ， Peters J， Hawkins D， et al. The tight skin 2 mouse[J].Arthritis Rheum， 1995， 38：1791-1798.

[28] Gershwin ME， Abplanal PH， Castles JJ， et al. Characterization of a spontaneous disease of white leghorn chickens resembling progressive systemic sclerosis (scleroderma)[J].J Exp Med， 1981， 153：1640-1659.

[29] Wick G， Andersson L， Hala K， et al. Avian models with spontaneous autoimmune diseases[J].Adv Immunol， 2006， 92：71-117.

[30] Eferl R， Hasselblatt P， Rath M， et al. Development of pulmonary fibrosis through a pathway involving the transcription factor Fra-2AP-1[J].Proc Natl Acad Sci UAS， 2008， 105：10525-10530.

[31] Maurer B， Busch N， Jüngel A， et al. Transcription factor fos-related antigen-2 induces progressive peripheral vasculopathy in mice closely resembling human systemic sclerosis[J].Circulation， 2009， 120：2367-2376.

[32] Bou-Gharios G， Garrett LA， Rossert J， et al. A potent far-upstream enhancer in the mouse pro alpha 2 (I) collagen gene regulates expression of reporter genes in transgenic mice[J].J Cell Biol， 1996， 134：1333-1344.

[33] Denton CP， Zheng B， Evans LA， et al. Fibroblast-specific expression of a kinase-deficient type II transforming growth factor β (TGFβ) receptor leads to paradoxical activation of TGFβ signaling pathways with fibrosis in transgenic mice[J].J Biol Chem， 2003， 278：25109-25119.

[34] Drab M， Verkade P， Elger M， et al. Loss of caveolae， vascular dysfunction， and pulmonary defects in caveolin-1 gene-disrupted mice[J].Science， 2001， 293：2449-2452.

[35] Del Galdo F， Lisanti MP， Jimenez SA. Caveolin-1， TGF-β receptor internalization， and the pathogenesis of systemic sclerosis[J].Curr Opin Rheumatol， 2008， 20：713.