閻曉慧 李瑞芳 張慧茹 尹艷杰 盧研博 盧亞麗

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

動(dòng)物內(nèi)源性多肽CGA-N46對(duì)念珠菌細(xì)胞增殖的影響

閻曉慧 李瑞芳 張慧茹 尹艷杰 盧研博 盧亞麗

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

CGA-N46是人嗜鉻粒蛋白N端具有抗真菌活性的多肽片段。采用MTT法檢測(cè)CGA-N46對(duì)克柔念珠菌生長(zhǎng)的抑制作用，以β-1，3-葡聚糖酶活性檢測(cè)克柔念珠菌細(xì)胞壁的完整性，采用PI檢測(cè)克柔念珠菌細(xì)胞膜通透性，用羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，0.5 mg/mL的CGA-N46能夠明顯抑制克柔念珠菌的細(xì)胞增殖能力；對(duì)其細(xì)胞壁的完整性及細(xì)胞膜的通透性沒(méi)有影響；CGA-N46能明顯降低線粒體膜電位。推測(cè)CGA-N46可能通過(guò)影響線粒體膜電位來(lái)抑制克柔念珠菌的生長(zhǎng)。

CGA-N46 克柔念珠菌 抑菌作用 線粒體膜電位

動(dòng)物內(nèi)源性多肽作為存在于動(dòng)物機(jī)體的非特異性免疫因子，對(duì)識(shí)別、抵抗和殺滅入侵動(dòng)物機(jī)體的有害微生物，維持動(dòng)物健康有重要作用。動(dòng)物內(nèi)源性多肽在快速殺菌的同時(shí)，還具有不易產(chǎn)生耐藥性、生物安全性高及中和內(nèi)毒素等特性，目前已成為世界抗菌領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊［1-3］。

近年來(lái)，侵染性真菌感染的發(fā)病率及死亡率不斷升高。侵染性真菌感染主要由念珠菌引起，其中白色念珠菌感染較為突出，但由于唑類抗真菌藥物的使用，使白色念珠菌的感染趨勢(shì)下降，而對(duì)氟康唑天然耐藥的克柔念珠菌的感染呈升高趨勢(shì)［4］?？巳崮钪榫亩玖﹄m稍弱于白色念珠菌，但其憑著強(qiáng)大的黏附力，附著人體表面并繁殖，引起口腔、肺部、陰道及全身多系統(tǒng)感染，從而嚴(yán)重威脅患者生命［5，6］。

嗜鉻粒蛋白Chromogranin A（以下簡(jiǎn)稱CGA）普遍存在于動(dòng)物內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中，由439個(gè)氨基酸組成，CGA中有保守的蛋白酶切位點(diǎn)，能夠被水解為具有不同生物功能的多肽片段［7］。前期研究克隆了CGA N端的不同基因片段，通過(guò)測(cè)定其抗菌活性，證實(shí)位于CGA N端31-76位氨基酸組成的CGA-N46具有較強(qiáng)的抗真菌活性［8］；抗菌譜試驗(yàn)表明CGA-N46可抑制多種致病真菌的增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞死亡，特別是對(duì)克柔念珠菌抑菌活性最強(qiáng)［9］，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

目前研究認(rèn)為，大部分抗菌肽的抑菌機(jī)制是膜結(jié)構(gòu)破壞型，如抗菌肽Protegrin能以多聚體的形式結(jié)合在細(xì)胞膜上，在細(xì)胞膜上形成孔道使細(xì)胞內(nèi)鉀離子滲漏導(dǎo)致細(xì)胞死亡［10］。少數(shù)抗菌肽能在不破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的情況下透過(guò)膜，與胞內(nèi)細(xì)胞器和大分子相互作用，廣泛影響胞內(nèi)核酸合成與修復(fù)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞壁與隔膜合成等生理活動(dòng)，從而發(fā)揮殺菌抑菌作用。如細(xì)菌素Lcn972主要通過(guò)與細(xì)胞壁前體特異性結(jié)合，從而阻礙細(xì)胞分裂［11］。本試驗(yàn)通過(guò)研究CGA-N46對(duì)克柔念珠菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及線粒體膜電位的作用，旨在闡明CGA-N46的作用機(jī)理，為其作為抗真菌藥物研究的靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

克柔念珠菌：鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、羅丹明123（Rh-123）、昆布多糖均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Triton X-100購(gòu)自華美生物工程有限公司，其它化學(xué)試劑為分析純。沙保氏（SDA）液體培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 CGA-N46對(duì)克柔念珠菌的抑制率 將克柔念珠菌接種于SDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。參照文獻(xiàn)［12］方法并加以改進(jìn)。將CGA-N46分別以不同濃度0、0.5、1、2、4、8 mg/mL加入含克柔念珠菌細(xì)胞（106個(gè)細(xì)胞/孔）的96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)不含細(xì)胞外、其他條件相同的空白對(duì)照。孵育3 h后，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，振蕩孵育20 min，至顆粒完全溶解，酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光度（A），以下列公式計(jì)算抑制率。

細(xì)胞抑制率（%）=［1-（加藥組A值-空白組A值）/（零濃度組A值-空白組A值）］×100% 1.2.2 β-1，3-葡聚糖酶活測(cè)定 采用還原法測(cè)定β-1，3-葡聚糖酶液與CGA-N46混合物的酶活性。將β-1， 3-葡聚糖酶液與0、1、2、4、8 mg/mL CGA-N46 孵育30 min，加入昆布多糖進(jìn)行還原反應(yīng)，設(shè)蒸餾水為空白對(duì)照，檢測(cè)550 nm 處的吸光光度值（A）。每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，取平均值，記為OD550；與不加CGA-N46反應(yīng)混合物進(jìn)行比較，差值記A550 nm。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將2組OD550差值折算成還原糖量。定義一個(gè)酶活單位（U）為每分鐘生成相當(dāng)于1 μg葡萄糖的還原糖所需的酶量。根據(jù)酶活單位計(jì)算不同濃度CGA-N46對(duì)β-1，3-葡聚糖酶活力的影響。

1.2.3 細(xì)胞膜通透性測(cè)定 取106CFU/mL克柔念珠菌與0、1、2、4、8 mg/mL CGA-N46作用3 h，收集菌體沉淀，20 mmoL/L pH6.0 的磷酸鈉緩沖液沖洗菌體沉淀2次，重懸后，加入PI（終濃度為50 μg/mL），室溫、避光作用10 min以上，在488 nm激發(fā)光下觀察熒光強(qiáng)度。以不添加CGA-N46組、加入 PI的同時(shí)加入Triton X-100（終濃度為0.3%）作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 線粒體膜電位測(cè)定 將克柔念珠菌接種于SDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整菌體終濃度為107CFU/mL，與不同濃度（0、1、2、4、8 mg/mL）CGA-N46作用3 h后，離心，取菌體沉淀，用PBS重懸菌體沉淀為相同濃度的菌懸液。每個(gè)樣品中加入1 μL Rh-123溶液（終濃度10 μg/mL），避光條件下靜置作用30 min，PBS洗滌1次。取20 μL制片，熒光顯微鏡下，藍(lán)光區(qū)進(jìn)行觀察。根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷線粒體膜電位變化情況。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS18.0 軟件進(jìn)行組間方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CGA-N46對(duì)克柔念珠菌的抑制作用

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的克柔念珠菌細(xì)胞經(jīng)不同濃度CGAN46處理3 h，MTT檢測(cè)CGA-N46對(duì)克柔念珠菌的抑制作用（表1）。

由表1可知，當(dāng)CGA-N46濃度為0.5 mg/mL時(shí)，細(xì)胞抑制率為41.11%；當(dāng)CGA-N46濃度增至8 mg/mL時(shí)，其細(xì)胞抑制率就增加至85.00%。由此可見，CGA-N46能使克柔念珠菌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制，且對(duì)克柔念珠菌細(xì)胞抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性升高。

2.2 CGA-N46對(duì)細(xì)胞壁的影響

通過(guò)測(cè)定β-1，3-葡聚糖酶活性檢測(cè)細(xì)胞壁的完整性。CGA-N46對(duì)β-1，3-葡聚糖酶活性的影響如圖所示（圖1），沒(méi)有經(jīng)過(guò)CGA-N46處理的β-1，3-葡聚糖酶的活性為21.986。當(dāng)CGA-N46濃度為1、2、4、8 mg/mL 時(shí)，反應(yīng)混合物中β-1，3-葡聚糖酶的活性沒(méi)有顯著變化，分別為22.114、22.144、22.015和22.085。說(shuō)明CGA-N46對(duì)β-1，3-葡聚糖酶活性沒(méi)有明顯影響，也即細(xì)胞壁的完整性不受CGA-N46的影響。

2.3 CGA-N46對(duì)克柔念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響

將不同濃度CGA-N46與克柔念珠菌作用3 h后，PI熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示。陽(yáng)性對(duì)照Triton X-100處理則出現(xiàn)紅色熒光，而經(jīng)不同濃度CGA-N46處理克柔念珠菌3 h后，克柔念珠菌內(nèi)沒(méi)有明顯的熒光，說(shuō)明CGA-N46不能破壞克柔念珠菌細(xì)胞膜的通透性。

2.4 CGA-N46對(duì)克柔念珠菌細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

將不同濃度CGA-N46與克柔念珠菌作用3 h后，用Rh-123熒光探針標(biāo)記CGA-N46處理過(guò)的克柔念珠菌細(xì)胞，以檢測(cè)線粒體膜電位的變化。如圖3所示，經(jīng)0、1、2、4、8 mg/mL CGA-N46處理3 h后，對(duì)克柔念珠菌進(jìn)行Rh-123染色發(fā)現(xiàn)，隨著CGA-N46濃度的逐漸升高，熒光強(qiáng)度高的克柔念珠菌細(xì)胞明顯減少，說(shuō)明CGA-N46能明顯降低其線粒體膜電位。

3 討論

MTT常用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)，是線粒體呼吸鏈氧化還原酶狀態(tài)的指示劑，活細(xì)胞線粒體內(nèi)激活態(tài)的氧化還原酶能使外源性MTT還原為極其難溶的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積于細(xì)胞內(nèi)，但是死細(xì)胞無(wú)此作用，故吸光度A值可間接反映細(xì)胞內(nèi)酶的活性及活細(xì)胞的數(shù)量［13］。本試驗(yàn)通過(guò)MTT法觀察到，不同濃度（0-8 mg/mL）CGA-N46 作用于克柔念珠菌3 h后，對(duì)克柔念珠菌細(xì)胞抑制率明顯升高，且呈一定的濃度依賴性。這說(shuō)明CGA-N46降低了菌體細(xì)胞線粒體氧化還原酶活性，達(dá)到抑菌作用，從而導(dǎo)致菌體細(xì)胞活性下降。

β-1，3-葡聚糖是多種真菌細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，對(duì)細(xì)胞壁的完整性以及維持細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定起著重要作用。β-1，3-葡聚糖在真菌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有特殊的重要性，可以作為研究細(xì)胞壁完整性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。房舒等［14］在研究蛇床子素結(jié)構(gòu)修飾物JS-B對(duì)辣椒疫霉病菌抑菌作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，JS-B能顯著降低辣椒疫霉菌絲中β-1，3-葡聚糖酶活性，可通過(guò)影響β-1，3-葡聚糖酶活性而起到抑制辣椒疫霉病菌生長(zhǎng)。經(jīng)CGA-N46處理后，β-1，3-葡聚糖酶活性沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明CGA-N46 可能不是通過(guò)抑制克柔念珠菌β-1，3-葡聚糖酶活性而起到抑菌作用。

電鏡觀察可以準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的形態(tài)但不能精確地反映細(xì)胞膜通透性的變化，而紫外分光光度法由于胞內(nèi)蛋白及核酸泄漏量很低，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，該方法的精確度和靈敏度都不理想［15］。熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、樣品用量少、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)熒光探針PI檢測(cè)CGA-N46處理后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化，可以精確地表達(dá)細(xì)胞膜通透性的變化。細(xì)胞膜受損主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜通透性增加，而 PI 不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷后才可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與核酸結(jié)合發(fā)出熒光。Zendo等［16］對(duì)乳球菌屬抗菌肽nisinA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，nisin A的N端和細(xì)胞膜上的LipidⅡ形成膠束復(fù)合物，C端插入細(xì)胞膜中，在細(xì)胞膜上產(chǎn)生空洞，改變了細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)離子和ATP外泄后死亡?？巳崮钪榫?jīng)不同濃度CGAN46處理3 h后仍未發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加或很少被染色，說(shuō)明CGA-N46不能破壞克柔念珠菌細(xì)胞膜的通透性。

線粒體膜電位下降是細(xì)胞死亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)生較早的事件。一旦線粒體膜電位降低，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡過(guò)程，啟動(dòng)凋亡［17］。當(dāng)線粒體膜電位下降，線粒體的形態(tài)和功能就發(fā)生了改變。線粒體熒光探針Rh-123 能特異性地與活細(xì)胞線粒體結(jié)合指示細(xì)胞生活代謝狀態(tài)。在各種刺激下，線粒體Rh-123 熒光強(qiáng)度檢測(cè)，可代表線粒體數(shù)量和線粒體功能狀態(tài)。Rh-123熒光強(qiáng)度下降，說(shuō)明線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電位差下降，不能提供足夠的電位梯度使標(biāo)記物被吸收和保留在線粒體內(nèi)；電位差越小，線粒體吸收的染料越少，熒光強(qiáng)度就越弱［18］。本試驗(yàn)采用Rh-123與克柔念珠菌細(xì)胞內(nèi)線粒體基質(zhì)結(jié)合，對(duì)線粒體進(jìn)行標(biāo)記，并采用熒光顯微鏡系統(tǒng)檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行定性分析，以此反映菌體細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的相對(duì)變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組克柔念珠菌細(xì)胞內(nèi)Rh-123熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，隨著CGA-N46濃度的增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)Rh-123 熒光強(qiáng)度逐漸減弱。提示CGA-N46可能通過(guò)降低線粒體膜電位從而抑制克柔念珠菌增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。這一研究結(jié)果和Fatma 等［19］的研究相同，他們發(fā)現(xiàn)真菌毒素AME能誘導(dǎo)人和動(dòng)物細(xì)胞線粒體膜電位降低，激活線粒體凋亡通道致使人和動(dòng)物細(xì)胞的存活能力降低，甚至死亡。

4 結(jié)論

CGA-N46對(duì)克柔念珠菌細(xì)胞壁的完整性和細(xì)胞膜的通透性沒(méi)有影響，可能通過(guò)降低克柔念珠菌線粒體膜電位抑制細(xì)胞的增殖作用。在這一過(guò)程中，CGA-N46是否通過(guò)降低線粒體膜電位來(lái)誘發(fā)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡，還需要進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Effect of Animal Endogenous Polypeptide CGA-N46 on Cell Proliferation of Candidas

Yan Xiaohui Li Ruifang Zhang Huiru Yin Yanjie Lu Yanbo Lu Yali
（College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001）

CGA-N46 is an N terminal derived peptide of human Chromogranin A (CGA) that has anti-fungal activities. The growth inhibition effect onCandida kruseiwas measured with MTT assay. The cell wall integrity ofCandida kruseiwas examined by monitoring β-1,3-glucanase activity. The effect of CGA-N46 on the permeability ofCandida kruseimembrane was examined using Propidium iodide detection. The effect of CGA-N46 on mitochondrial membrane potential was evaluated through Rh-123 assay. The results of showed 0.5 mg/mL CGA-N46 could significantly inhibit the proliferation of theC. kruseicells. CGA-N46 had no obvious effect on the β -1, 3-glucanase activity. There was no significant influence on the permeability ofC. kruseicell membrane; CGA-N46 could significantly decrease the mitochondrial membrane potential. A conclusion can therefore be made that CGA-N46 may inhibit the growth of Candidas by affecting the mitochondrial membrane potential.

CGA-N46Candida kruseiInhibitory effect Mitochondrial membrane potential

2013-09-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071922）, 河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（112102310325）, 河南工業(yè)大學(xué)科學(xué)研究基金研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（12YJCX51）

閻曉慧，女，碩士研究生，研究方向：微生物與生化藥學(xué); E-mail：879153058@qq.com

李瑞芳，女，博士，教授，研究方向：微生物與生化藥學(xué); E-mail：lrf@haut.edu.cn