方月琴郭娟寧陸豪杰朱國強

（1. 江蘇健雄職業(yè)技術(shù)學院，蘇州 215411；2. 揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，新鄉(xiāng) 453003）

多功能M13KE噬菌體展示系統(tǒng)的建立

方月琴1郭娟寧2陸豪杰1朱國強3

（1. 江蘇健雄職業(yè)技術(shù)學院，蘇州 215411；2. 揚州大學獸醫(yī)學院，揚州 225009；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院，新鄉(xiāng) 453003）

以M13KE噬菌體為起始載體，建立一種無需輔助噬菌體的較長片段多肽庫展示系統(tǒng)，以解決當前噬菌體展示僅能篩選短肽庫現(xiàn)象，并擴大靶向高通量篩選范疇。根據(jù)M13KE次要外殼蛋白（Minor coat protein of wild-type M13KE，wt-pIII）基因III（wt-gene III）結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，設(shè)計并擴增出能發(fā)揮其基因功能的截短基因III（Truncated gene III，tgIII）；通過拼接-重疊-延伸PCR（Splice-overlapping-extension polymerase chain reaction，SOEing-PCR）獲得含啟動子、信號肽和結(jié)構(gòu)基因的融合基因片段，將其插入至M13KE載體的合適部位，進行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE和Western blot分析。同時在wt-gIII和tgIII部位分別插入HA和c-Myc多肽標簽，再次進行表達和檢測。結(jié)果顯示，tgIII被插入到M13KE的非必需部位，利用抗蛋白III（anti-M13 pIII）抗體進行Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，wt-gIII和tgIII均能表達pIII（protein III，pIII）；anti-HA和c-Myc抗體都能檢測到2個標簽蛋白和pIII蛋白質(zhì)的表達。獲得一種多功能M13KE載體，具有既能表達短片段多肽庫，也能表達較長片段多肽庫的潛能，而且無需輔助噬菌體，可用于更大范圍的高通量靶向篩選。

靶向高通量篩選 噬菌體展示系統(tǒng) M13KE 長片段多肽庫

噬菌體展示系統(tǒng)是以絲狀噬菌體為載體，將外源蛋白或多肽的基因表達產(chǎn)物與其外殼蛋白融合，使得外源蛋白或多肽在其表面得以展示，進而通過篩選獲得表達有特異性蛋白質(zhì)或多肽的噬菌體，再進行富集［1］。其優(yōu)點是直接將基因型與表型聯(lián)系到一起，再利用其與配體的特異性親和力，將目的蛋白質(zhì)或多肽篩選出來。所用絲狀噬菌體主要有M13KE、fd和fe等，它們通過gIII侵染攜帶F’的大腸桿菌，而外源基因大多插入到gIII中，以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面［2］。

但是如果外源基因過長會造成噬菌體感染能力的失去，因而現(xiàn)有展示系統(tǒng)只能夠表達短片段多肽，很多時候不能夠滿足蛋白質(zhì)靶向篩選的要求［3］?；蛘呤窃谳o助噬菌體存在的情況下完成長肽篩選，但是增加了操作過程的繁瑣性［4-8］。因此，本研究以M-13KE為載體［9］進行改造，目的是建立針對較長片段多肽或蛋白質(zhì)庫篩選、又不影響其復(fù)制感染能力、且無需輔助噬菌體存在的高通量噬菌體展示系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 PCR獲得tgIII

通過兩步PCR法獲得M13KE載體（New England Biolabs，USA）wt-gIII的啟動子與信號肽的基因序列。兩步PCR包括了拼接PCR（Dual-assembly PCR，DA-PCR）和延伸PCR（Over-extension PCR，OE-PCR）［10］。所需引物和步驟如圖1所示。接著以M13KE雙鏈DNA為模板PCR擴增得到gIII的C-端區(qū)域DNA，引物為M13F（5'-3'）：ACT AGT GGT GGC TCT GGT TCC GGT GAT TTT G；M13R（5'-3'）：GCC GGA ATT CGC GCA CTG CTT ATT AAG ACT CCT TAT TAC。最后利用SOEing-PCR法將上列3種DNA序列進行拼接，得到tgIII全長。

PCR體系為37.5 μL，在1×pfu緩沖液中加入200 μmol/L dNTP，7.5 U pfu DNA聚合酶（Fermentas，USA），合適的DNA引物和DNA模板。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，53℃ 30 s和72℃ 45 s共25個循環(huán)，之后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.2 基因克隆

tgIII首先插入至pJETTMPCR克隆載體（Fermentas，USA），經(jīng)克隆PCR、酶切、測序鑒定序列正確后，用BstI酶（New England Biolabs，USA）將tgIII片段切下，膠純化（Qiagen，Germany）；同時將M13KE用該酶切后，膠純化；再將兩者進行連接克隆入M13KE，最終得到M13KE-tgIII載體。

1.3 標簽蛋白HA和c-Myc的克隆

分別將HA序列插入tgIII，c-Myc序列插入wtgIII信號肽序列的3'端。首先根據(jù)氨基酸密碼子優(yōu)化原則設(shè)計一對反向互補引物，兩端攜帶相應(yīng)粘末端，接著將其進行94℃高溫變性、55℃退火連接，形成具有相應(yīng)酶切位點粘末端的互補雙鏈，與酶切的M13KE載體連接。HA標簽兩端為SacII和SpeI酶切位點，引物序列為HA-F（5'-3'）：GGC CGA ATA CCC ATA CGA CGT TCC AGA CTA CGC TTC，HA-R（5'-3'）：GGC CGA AGC GTA GTC TGG AAC GTC GTA TGG GTA TTC。C-Myc兩端為EagI酶切位點對應(yīng)序列，引物序列為：Myc-F（5'-3'）：GGC CGA ACA GAA GCT GAT CTC TGA AGA AGA CCT GTC，Myc-R（5'-3'）：GGC CGA CAG GTC TTC TTC AGA GAT CAG CTT CTG TTC。最終獲得的載體稱為M13KE-HA-Myc。

1.4 M13KE噬菌體蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析

3 mL LB培養(yǎng)液（1 L ddH2O中10 g 蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，121℃滅菌25 min）中加入60 μL過夜培養(yǎng)的ER2738菌和2.5 μL噬菌體上清，37℃培養(yǎng)至指數(shù)生長階段，轉(zhuǎn)移至40 mL LB液中培養(yǎng)1 h，加入不同濃度IPTG溶液（Fermentas，USA）進行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)結(jié)束，將培養(yǎng)液離心≥6 000 r/min，8 min。上清液轉(zhuǎn)移至干凈試管中，加入1/5體積比的PEG/NaCl 溶液，混勻，4℃沉淀至少5 h。12 000 r/min 4℃離心20 min，棄上清，沉淀溶于TBS（1L ddH2O中 6.06 g Tris，8.766 g NaCl，0.5%（V/V）Tween-20）。噬菌體蛋白質(zhì)在12% SDS-PAGE上電泳分離，染色（Bio-Rad，USA）。

1.5 噬菌體蛋白質(zhì)的Western印跡分析

噬菌體蛋白質(zhì)SDS-PAGE分離之后，經(jīng)小型Bio-Rad Trans-blot轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad，USA），30V低溫過夜或是60 V室溫3 h，轉(zhuǎn)移至纖維素膜（Millipore，Germany）。接著取出纖維素膜，在5%脫脂牛奶封閉液中封閉2-3 h，一抗（Anti-M13 pIII 1：200，New Engl-and Biolabs，USA；anti-c-Myc［11，12］，anti-HA［13］1∶1 000，Sigma-Aldrich，USA）4℃孵育過夜，TBST充分洗滌，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗（1∶8 000，Sigma-Aldrich，USA）孵育2 h，TBST充分洗滌4次后利用HRP顯色試劑盒（Bio-Rad，USA）進行蛋白質(zhì)顯色。

2 結(jié)果

2.1 tgIII的基因合成

tgIII由3部分組成，包括啟動子、信號肽和C端gIII（圖2），與wt-gIII相比，刪去了不影響pIII功能的N端gIII序列。啟動子和信號肽為210 bp，C端gIII為490 bp。首先通過DA-PCR和OE-PCR方法獲得啟動子-信號肽序列，之后將其與C-端gIII的PCR產(chǎn)物經(jīng)SOEing-PCR進行拼接，獲得tgIII全長約700 bp，兩端攜帶BstI酶切位點（圖3）。

2.2 M13KE-tgIII載體構(gòu)建

tgIII首先插入pJET克隆載體，經(jīng)酶切、測序明確序列正確后，BstI酶切，膠純化得到tgIII片段。M13KE（圖4-A）也經(jīng)該酶酶切，膠純化，與tgIII片段進行連接，轉(zhuǎn)化，鑒定，最終得到M13KE-tgIII載體（圖4-B）。

2.3 M13KE-tgIII載體的噬菌體蛋白

SDS-PAGE和Western印跡分析，M13KE-tgIII載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，分離出噬菌體蛋白質(zhì)，在SDSPAGE電泳銀染圖（圖5）能見到5.5 kD左右的主要衣殼蛋白pVIII，其他蛋白質(zhì)在電泳圖上不可見。

用anti-M13 pIII單克隆抗體進行Western blot檢測，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)有2個不同分子量大小的pIII，wt-pIII約為70 kD，tpIII電泳所示分子量大小約35 kD，與文獻報道一致［14］。

2.4 構(gòu)建M13KE-HA-tgIII-Myc載體和標簽蛋白表達分析

通過克隆技術(shù)分別將c-Myc和HA標簽插入tgIII和wt-gIII的信號肽與成熟pIII之間。之后分別利用相應(yīng)抗體進行檢測。375 μmol/L IPTG 誘導(dǎo)6 h，分別檢測到c-Myc標記融合蛋白wt-pIII（圖7-A）和HA標記的tpIII（圖7-B），表明載體M13-HA-Myc順利表達2個不同分子量大小的pIII蛋白。

3 討論

目前市場上流行的New England Biolabs公司的M13KE噬菌體展示系統(tǒng)，是在wt-gIII的信號肽與基因之間插入多肽庫，但均為7 aa，9 aa的短肽庫，往往不能滿足長肽鏈的篩選［15，16］。本研究構(gòu)建一種攜帶兩個gIII的M13KE載體，其中wt-gIII保留其感染宿主細菌的能力，tgIII攜帶長片段多肽庫，用于進行靶向篩選。

為減少插入大片段基因?qū)13KE噬菌體功能的影響，wt-gIII中C端區(qū)域被刪去，保留啟動子、信號肽和N端區(qū)域組成的tgIII，其轉(zhuǎn)錄得到的tpIII能夠更有效地將其攜帶的蛋白質(zhì)表達到噬菌體外殼，但是對噬菌體包裝與分泌不造成影響［1］。由于tgIII刪除了C端區(qū)域，失去了感染宿主菌及包裝蛋白的能力，因此在攜帶有tgIII的噬菌體中，同時需存在wt-gIII以保持感染與成熟蛋白復(fù)制包裝的能力［17］，或者通過增加輔助噬菌體以完成上述功能［18］。本研究即采用前者，即保留wt-gIII的感染能力。

經(jīng)PCR、克隆步驟得到M13KE-tgIII后，用anti-pIII單克隆抗體對兩個pIII進行蛋白質(zhì)表達檢測，能檢測到2個不同分子量大小的pIII。之后在wt-gIII和tgIII的啟動子與表達區(qū)域之間分別插入c-Myc和HA標簽蛋白，以檢測它們與pIII融合蛋白的表達。經(jīng)anti-c-Myc和anti-HA 2種單克隆抗體檢測，均在相應(yīng)分子量大小的位置出現(xiàn)pIII蛋白質(zhì)。這說明tgIII的成功克隆與tpIII的成功表達，并表明了tgIII的信號肽之后進行克隆長片段多肽庫的潛能。這也是本課題下一步研究方向。

本試驗構(gòu)建的M13KE-tgIII載體既可在wt-gIII部位插入短片段多肽，用于短肽庫的構(gòu)建，也具有在tgIII上插入長片段多肽庫的潛能，有望進行短肽庫與長肽庫之間的篩選，簡化了多肽庫篩選的操作，擴大了噬菌體展示高通量篩選的選擇。

4 結(jié)論

以M13KE噬菌體為起始載體，通過SOEing-PCR法獲得能發(fā)揮gIII基因功能的tgIII，并將tgIII插入至M13KE載體的合適部位，獲得一種能表達長片段多肽的M13KE-tgIII載體，檢測到tgIII基因表達。同時在wt-gIII和tgIII部位分別插入HA和c-Myc多肽標簽，再次進行表達和檢測，能檢測到2個標簽蛋白，最終得到M13KE-tgIII和M13-HA-gIII-Myc載體。

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（責任編輯 李楠）

Construction of a Multipurpose M13KE Phage Display System

Fang Yueqin1Guo Juanning2Lu Haojie1Zhu Guoqiang3
（1. Dept. of Biological and Chemical Engineering，Chien-Shiung Institute of Technology，Suzhou 215411；2. College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou 225009；3. Dept. of Medical School，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003）

It was to engineer a multipurpose M13KE phage display vector from M13KE wild-type phage for the longer peptide or protein display library without helper phage, as well as to expand the scope of targeting high-throughput screening. Based on the relationship of the structure and function of minor coat protein of wild-type M13KE, a truncated gene III encoding minor coat protein from M13KE phage was cloned and a fusion gene fragment containing alac/tacpromoter and the gene III signal peptide sequence was assembled using splice-overlappingextension polymerase chain reaction. SDS-PAGE and Western blot analysis with anti-M13 pIII monoclonal antibody was employed to detect the expression of the recombinant gene III. Two peptide tags, c-Myc and HA tag sequences were fused to the recombinant gene for expression and analysis, and the following screening steps. The recombinant gene III（tgIII）was inserted into the unessential part of M13KE and the corresponding protein III was detected with SDS-PAGE and Western blot with the anti-pIII antibody. The tgIII containing two tags expressed both c-Myc and HA peptides using methods of SDS-PAGE and Western blot with their specific monoclonal antibodies. We made the construction of a multipurpose M13KE phage display system. In the near future, we hope to apply this engineered phage display vector to carry longer peptide libraries for high-throughput screening without helper phage.

High-throughput screening Phage display M13KE Longer peptide library

2013-08-08

國家自然科學基金項目（31270171），江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目

方月琴，女，博士研究生，助理研究員，研究方向：生物醫(yī)學；E-mail：yueqinfang@aliyun.com

朱國強，男，博士，教授，研究方向：病原微生物和免疫學；E-mail：yzgqzhu@yzu.edu.cn