高北 陶妍

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）LEAP2成熟肽在大腸桿菌中的融合表達

高北 陶妍

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

以斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肝臟為基因克隆的材料，通過RT-PCR對編碼LEAP2成熟肽區(qū)域41個氨基酸的cDNA片段（mLEAP2）進行克隆。根據(jù)斑點叉尾鮰與其他魚類、哺乳動物及兩棲動物等其他物種LEAP2成熟肽區(qū)域氨基酸序列的比對結果，發(fā)現(xiàn)存在14個保守的氨基酸殘基，其中4個高度保守的半胱氨酸殘基位于成熟肽的羧基端區(qū)域，在空間上可形成兩對二硫鍵，推測與LEAP2的抗菌活性有關。進一步構建重組表達質粒pET32a-mLEAP2，使mLEAP2基因與攜帶有6 × His-tag標簽和腸激酶識別位點的硫氧還蛋白trxA基因融合，轉化至大腸桿菌BL21（DE3）后，在25℃下，經(jīng)0.7 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)16 h后，成功表達了trxA-mLEAP2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE顯示，細胞經(jīng)超聲破碎后，上清和沉淀中均含融合蛋白，采用固化金屬離子親和層析（IMAC）對其進行純化，得到了純化的融合蛋白。

斑點叉尾鮰 LEAP2成熟肽 RT-PCR 融合表達

抗菌肽是一類內(nèi)源性的具有強抗菌作用的陽離子短肽，其分子量一般為1.5-10 kD，是生物先天免疫功能的重要組成成分［1］，因其具有天然、無毒的優(yōu)勢，有望作為綠色飼料添加劑部分替代抗生素。此外，抗菌肽又被稱為“第二防御體系”，對一般抗生素不能起效的許多真菌、原蟲、有包膜的病毒乃至癌細胞等有抑制作用［2］。從人血液超濾產(chǎn)物中得到含有4對和2對二硫鍵的肝臟表達的抗菌肽，分別被稱為肝臟表達的抗菌肽-1（Hepcidin，LEAP1）和抗菌肽-2（LEAP2）。關于LEAP1的研究已較為深入，而關于LEAP2的研究報道則相對較少。魚類中的LEAP2基因首次發(fā)現(xiàn)于虹鱒魚［3］（Oncorhynchus mykiss）體內(nèi)。近幾年以來，其他一些魚類的LEAP2基因被相繼克隆，如斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）［4，5］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）［6］、大黃魚（Larimichthys crocea）［7］、 草 魚（Ctenopharyngodon idella）［8］等。斑點叉尾鮰LEAP2基因含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，該基因編碼的多肽由94個氨基酸殘基組成，自氨基端起Pro-28與Ser-29之間可產(chǎn)生一個酶切位點，將28個氨基酸殘基的信號肽與66個氨基酸殘基組成的LEAP2原前體肽分開；原前體肽由前體肽區(qū)域和成熟肽區(qū)域組成，經(jīng)加工后釋放出具生物活性的含41個氨基酸殘基的成熟肽［4，5］，兩對二硫鍵就位于該成熟肽區(qū)域內(nèi)。傳統(tǒng)的制備抗菌肽的方法主要是從生物的組織器官中提取，但該法存在許多問題，如提取量低、雜質種類復雜、易失活等，嚴重制約了抗菌肽的開發(fā)和應用，而化學合成法成本很高。因此，通過基因工程技術制備抗菌肽無疑是一條良好的途徑。張虹等［4］通過RTPCR對包括信號肽在內(nèi)的LEAP2 全長cDNA進行了克隆并實現(xiàn)在E.coliBL21（DE3）中的原核表達。本研究以斑點叉尾鮰肝臟為材料，通過RT-PCR對編碼LEAP2成熟肽區(qū)域的cDNA進行克隆，并構建重組融合表達載體對其進行原核表達，為進一步研究LEAP2的抗菌活性奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 用于模板的斑點叉尾鮰肝臟cDNA為本實驗室保存。用于質粒復制和cDNA克隆的大腸桿菌菌株DH5α和用于目的蛋白表達的大腸桿菌BL21（DE3）購自北京天根生物科技公司；克隆質粒pSURE-T購自北京艾得萊生物科技公司；表達質粒pET-32a（+）購自美國Novagen公司。

1.1.2 主要試劑及設備 RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；Ex Taq DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoR I和Hind III購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、DNA 分子量marker和蛋白質分子量marker購自北京天根生物科技公司；IPTG購自上海生物工程有限公司；LB營養(yǎng)肉湯及其他化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，為國產(chǎn)分析純；引物合成及測序由上海生物工程有限公司完成；蛋白純化儀Profinia及其固化金屬離子親和層析柱（IMAC）和脫鹽柱購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 LEAP2成熟肽基因的cDNA克隆 以前期研究中通過逆轉錄得到的斑點叉尾鮰肝臟cDNA為模板［4］，參考LEAP2全長cDNA序列（GenBank ID：NM_001200205）設計含有EcoR I酶切位點的正向引物MLF（5'-CGGAATTCATGACACCCCTTTGGAGAATC-3'）和含有Hind Ⅲ酶切位點的反向引物MLR（5'-CCCAAGCTTTTAGGAAATTATAGGTTGGCTAAAGG-3'），對編碼斑點叉尾鮰LEAP2成熟肽區(qū)域的cDNA（mLEAP2）進行克隆（圖1）。PCR反應體系如下：2.5 μL第一股cDNA、各4 μL 10 mol/L的正向和反向引物、1 μL Taq Plus DNA Polymerase（2.5 U/μL）、10 μL10×Taq Plus Buffer、8 μL 2.5 mmol/L dNTP，用無菌水將反應液調至100 μL。PCR反應條件如下：94℃預變性3 min，30個循環(huán)：94℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸1 min，最終72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后獲得的目的片段“mLEAP”與pSURE-T Simple質粒載體按3∶1比例、在T4 DNA連接酶作用下，16℃連接過夜；轉化至DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)過夜；挑選陽性克隆進行DNA測序。

1.2.2 LEAP2成熟肽融合表達質粒的構建 將上述經(jīng)DNA測序確證的、含pSURE-mLEAP2重組質粒的菌落經(jīng)37℃、220 r/min液體培養(yǎng)過夜后，用質粒小提試劑盒抽提質粒；對得到的重組質粒進行EcoRI和Hind Ⅲ雙酶切處理，反應體系和條件如下：10 μL pSURE-mLEAP2重組質粒、2 μL 10×M 緩沖液、1 μLEcoRI（20 U/μL）、1 μLHindⅢ（20 U/μL）、6 μL ddH2O；37℃保溫3 h；經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段進行DNA純化。

同時，對pET-32a（+）表達質粒進行雙酶切，反應體系如下：40 μL pET-32a（+）質粒、4 μL10×M緩沖液、2 μLEcoR I（20 U/μL）、2 μLHindⅢ（20 U/μL）、2 μL ddH2O；37℃保溫4 h；經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下線性質粒進行DNA純化。

將上述含酶切位點的成熟肽片段mLEAP2與線性pET-32a（+）質粒按如下體系進行連接：1 μL 10×T4 DNA連接酶緩沖液、1 μL線性pET-32a（+）質粒、7 μL目的片段、1 μL T4 DNA連接酶；16℃連接過夜；連接液轉化DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)過夜；經(jīng)PCR鑒定的陽性克隆進行DNA測序。

1.2.3 LEAP2成熟肽在大腸桿菌中的表達及表達產(chǎn)物的純化 經(jīng)測序確證的陽性菌落經(jīng)液體培養(yǎng)后，進行質粒提純；取1 μL pET32a-mLEAP2重組質粒轉化E.coliBL21（DE3），篩選陽性菌落接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的5 mL LB培養(yǎng)液中，37℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8；以1∶50的比例接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的1 000 mL LB培養(yǎng)液中，同上培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8；然后，加入終濃度為0.7 mmol/L的IPTG，在25℃，110 r/min進一步培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)液中均加入終濃度為1%的葡萄糖以減少目的蛋白的本底表達水平。通過低溫離心（8 000 r/min、4℃、10 min）收集菌體，用預冷的PBS（140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4，pH7.3）重懸菌體，對菌體進行超聲破碎后，再低溫離心（12 000 r/min、4℃、10 min）收集上清和沉淀，分別進行Tricine-SDS-PAGE電泳分析，濃縮膠濃度4%，分離膠濃度10%，含0.1% SDS和0.1 mol/L Tricine。電泳結束后用0.1%的考馬斯亮藍R-250對凝膠進行染色，用25%的甲醇和7%的醋酸混合液脫色。

先使用Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges對上清進行固化金屬離子親和層析（IMAC），然后通過Bio-Scale Mini Bio-Gel P-6 Desalting Cartridges進行脫鹽，得到純化的融合蛋白trxA-mLEAP2，對其進行Tricine-SDS-PAGE分析。

1.2.4 基于LEAP2氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹構建分子系統(tǒng)樹采用MEGA5.05鄰位相聯(lián)法（Neighbor-Joinging）構建，各結點的置信度由自引導值估計，重復次數(shù)為1 000。用于構建分子系統(tǒng)樹的LEAP2全長氨基酸序列來自于NCBI網(wǎng)站，它們的序列號分別為：斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus，ID：NM_ 001200205）、長鰭叉尾鮰（Ictalurus furcatus，ID：AAX45792）、黃顙魚（Tachysurus fulvidraco，ID：ACT33044）、虹鱒魚同工型A（Oncorhynchus mykissA，ID：AAR11766）、虹鱒魚同工型B（Oncorhynchus mykissB，ID：AAR11767）、牙鲆（Paralichthys olivaceus，ID：ACB97648）、人（Homo sapiens，ID：NP_ 443203）、 家 鼠（Mus musculus，ID：NP_694709）、東非狒狒（Papio anubis，ID：NM_001168764）、熱帶爪蟾（Xenopus laevis，ID：NM_001112914）、挪威大鼠（Rattus norvegicus，ID：NM_001126081）、原雞（Gallus gallus，ID：NM_001001606）。

2 結果

2.1 斑點叉尾鮰成熟肽基因的cDNA序列及推斷的氨基酸序列

以斑點叉尾鮰肝臟的第一股cDNA為模板、以MLF和MLR為引物，擴增得到一個126 bp的片段（圖2）。測序結果（圖3）表明該片段的兩端分別引入了EcoR I和HindⅢ兩個酶切位點；除去酶切位點后，該片段編碼了一段由41個氨基酸殘基組成的LEAP2成熟肽部分，4個保守的半胱氨酸殘基位于該區(qū)域內(nèi)。

2.2 斑點叉尾鮰LEAP2成熟肽一級結構的氨基酸序列分析及與其他生物的比較

采用Clustal W軟件對斑點叉尾鮰LEAP2成熟肽與其他魚類、哺乳動物和兩棲動物等的LEAP2成熟肽一級結構進行分析和比對，結果（圖4）顯示，不同來源成熟肽的氨基酸序列顯示了14個保守的氨基酸殘基（灰色陰影和黑色方框），其中包括與LEAP2抗菌活性有關的4個高度保守的半胱氨酸殘基（黑色方框）。斑點叉尾鮰mLEAP2與長鰭叉尾鮰之間顯示了最高的序列同源性，為100%；與黃顙魚之間的同源性略低，為98%；與斑馬魚、虹鱒2個同工型以及牙鲆之間的同源性為63%-85%。斑點叉尾鮰與哺乳動物之間顯示了低的氨基酸序列同源性。

2.3 基于LEAP2氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹分析

由圖5可見，分子系統(tǒng)樹分為兩大組，一組是魚類，另一組是其他物種。魚類組中斑點叉尾鮰與長鰭叉尾鮰顯示了最近的親緣關系，它們一起形成了由自引導值91支持的一個小分支。系統(tǒng)樹分析結果與mLEAP2氨基酸序列比對的結果是一致的。

2.4 重組融合表達質粒的構建與鑒定

重組融合表達質粒pET32a-mLEAP2的構建如圖6所示。通過菌落PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)在近800-900 bp處有清晰條帶（圖7），與理論相符，初步確定為陽性菌落，經(jīng)DNA測序證明目的片段mLEAP2已正確連接到pET-32a（+）表達載體上，并且核苷酸序列未發(fā)生任何堿基突變。

2.5 mLEAP2在E.coli BL21（DE3）中的融合表達及純化

重組融合表達質粒pET32a-mLEAP2轉化至E.coliBL21（DE3）后，經(jīng)IPTG誘導培養(yǎng)16 h后，對菌體總蛋白和經(jīng)超聲破碎后的細胞上清及沉淀進行Tricine-SDS-PAGE分析。由圖8可見，與各種對照（泳道1、3、4）相比，含pET32a-mLEAP2的誘導菌的總蛋白（泳道2）在近26 kD處有明顯的條帶，與trxA-mLEAP2融合蛋白的理論分子量相符；此外，該菌體細胞經(jīng)超聲破碎離心后得到的上清（泳道5）及沉淀（泳道6）中都顯示了目的條帶，表明trxA-mLEAP2融合蛋白除了以可溶性的形式表達之外，還存在于包涵體中。

對超聲破碎后的上清先進行固化金屬離子親和層析（IMAC），然后通過Bio-Scale Mini Bio-Gel P-6 Desalting Cartridges進行脫鹽，得到純化的trxA-mLEAP2融合蛋白，其Tricine-SDS-PAGE分析結果如圖9所示，在近26 kD處有清晰的條帶。

3 討論

哺乳動物的mLEAP2第29-32位有一個堿性氨基酸簇“-RKRR-”，第19-22位有一個酸性氨基酸簇“-DDSE-”，這兩段保守的氨基酸簇被推測有助于LEAP2分子間的相互作用以及與細菌細胞膜的作用［11］。而斑點叉尾鮰和一些其他魚類在這兩個相應的位置所對應的序列是“-RKGH-”和“-NNYE-”，關于魚類LEAP2抑菌機理的研究報道甚少。雖然來自不同生物的LEAP2氨基酸序列之間存在差異，但在它們羧基端區(qū)域均存在4個高度保守的半胱氨酸殘基，證明在空間結構上由此形成的二硫鍵與LEAP2的抗菌活性有關［9］。

通常稀有密碼子會影響目的基因在原核系統(tǒng)中的表達。當同一種氨基酸可由多個密碼子編碼時，大腸桿菌總是頻繁使用某一個或幾個密碼子而幾乎不使用其他的密碼子，后者對于大腸桿菌來說就是稀有密碼子。本文表達的LEAP2成熟肽氨基酸對應的41個密碼子中含有10個稀有密碼子，并且第25-27位密碼子為3個連續(xù)的稀有密碼子“ACG、GGA、AUA”，理論上可能會影響LEAP2的表達產(chǎn)量。由于未作密碼子優(yōu)化的對比試驗，具體結論還有待驗證。

本研究選擇pET-32a（+）作為原核表達載體，該載體使目的基因的轉錄和翻譯處于T7噬菌體信號控制之下，只有加入IPTG誘導劑后才能產(chǎn)生大量T7RNA聚合酶，從而使外源目的蛋白得以表達，因此，在加入誘導劑之前可以保證工程菌生長良好，有效防止了工程菌的自殺行為。pET-32a（+）攜帶有助于提高溶解性的硫氧還蛋白“trxA”編碼序列，與目的蛋白基因形成融合基因，進而表達融合蛋白；另一方面，為提高表達產(chǎn)物的可溶性，選擇了較低的表達溫度25℃，結果表明確實獲得了一定量的可溶性目的蛋白。但抑菌試驗結果表明純化的融合蛋白未顯示明顯的抑菌活性，其原因可能與trxA 融合頭的存在有關，因其影響了產(chǎn)物的折疊，進而影響了生物學功能［9］。trxA 融合頭的羧基端含有腸激酶識別位點，可望通過融合頭的切除，獲得具生物學活性的LEAP2成熟肽。該項工作目前正在進行中。

4 結論

從斑點叉尾鮰肝臟中克隆到編碼LEAP2成熟肽的基因mleap2，該基因編碼的成熟肽由41個氨基酸殘基組成；4個高度保守的半胱氨酸殘基位于成熟肽的羧基端區(qū)域。以pET-32a（+）為表達質粒，成功構建融合表達質粒pET32a-mLEAP2，轉化至工程菌E.coliBL21（DE3）后，在25℃下，經(jīng)0.7 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)16 h后，成功表達了“trxA-mLEAP2”融合蛋白。

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（責任編輯 李楠）

Fusion Expression of Channel Catfish（Ictalurus punctatus）LEAP2 Mature Peptide in Escherichia coli

Gao Bei Tao Yan
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Antimicrobial peptides generally are some small molecule peptides with strong ability to fight against microbial organisms. They play an important role in the host’s immune system and are considered to be good substitutes for traditional antibiotics. A cDNA fragment（mLEAP2）encoding the LEAP2（liver-expressed antimicrobial peptide 2）mature peptide consisted of 41-amino-acid was cloned from the liver of channel catfish（Ictalurus punctatus）by RT-PCR. When the amino acid sequence of channel catfish mLEAP2 was compared with those of poikilothermal fish and other species, fourteen residues were observed at conserved positions, especially four highly conserved cysteine residues occurred at C-terminal regions of these mLEAP2s, suggesting that two disulfide bridges resulted from these four cysteines possibly related to antimicrobial activity of LEAP2. Subsequently, themLEAP2gene was fused with atrxApartner gene with a 6×His-tag and an enterokinase site to construct the recombinant expression plasmid pET32a-mLEAP2. The fusion protein “trxA-mLEAP2” was successfully expressed inE .coliBL21（DE3）at 25℃ after a 16 h induction with 0.7 mmol/L IPTG. Tricine-SDS-PAGE showed that the fusion protein existed in both the supernatant and inclusion body after sonication and centrifugation. The purified fusion protein was successfully obtained by immobilized metal affinity chromatography（IMAC）.

Channel catfish LEAP2 mature peptide RT-PCR Fusion expression

2013-08-08

上海市教育委員會重點創(chuàng)新基金項目（11ZZ148）

高北，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)生物分子生物學；E-mail：wintergb@hotmail.com

陶妍，女，教授，碩士生導師，研究方向：水產(chǎn)生物分子生物學；E-mail：ytao@shou.edu.cn