張超 高樹林 杜丹妮 吳凡 董麗

（北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083）

牡丹WD40類轉(zhuǎn)錄因子基因PsWD40-1和PsWD40-2的分離與序列分析

張超 高樹林 杜丹妮 吳凡 董麗

（北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院 國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083）

利用已構(gòu)建的牡丹‘洛陽(yáng)紅’花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選得到2個(gè)與植物花青素苷合成WD40蛋白同源性較高的Unigene序列，分別命名為PsWD40-1和PsWD40-2。利用RT-PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)PsWD40-1和PsWD40-2最大閱讀框（ORF）序列進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果表明PsWD40-1序列包含一個(gè)1 035 bp的ORF，編碼一個(gè)344 aa的肽鏈；PsWD40-2序列包含一個(gè)1 032 bp的ORF，編碼一個(gè)343 aa的肽鏈。牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推測(cè)所編碼蛋白序列均具有典型的WD40結(jié)構(gòu)域。PsWD40-1蛋白序列與葡萄VvWDR2相似性為96%，PsWD40-2蛋白序列與葡萄VvWDR1相似性為87%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，PsWD40-1與葡萄VvWDR2、擬南芥AtAN11、陸地棉GhTTG2等序列聚在MP1分支，而PsWD40-2與葡萄VvWDR1、矮牽牛PhAN11、紫蘇PfWD40等序列聚在另一分支TTG1/PAC1分支。

牡丹 花青素苷合成 調(diào)節(jié)基因 WD40蛋白

花青素苷（Anthocyanins）是一類水溶性的類黃酮化合物，廣泛分布于植物細(xì)胞液泡中，它決定了大部分觀賞植物花瓣呈現(xiàn)出五彩繽紛的顏色［1］。已有研究表明，植物花青素苷的生物合成受結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的共同調(diào)控［2］，目前已分離和鑒定了3大類花青素苷合成的轉(zhuǎn)錄因子：MYB蛋白、bHLH蛋白和WD40蛋白［3］。

WD40也稱WDR（WD repeat）蛋白是一類古老的蛋白家族，其結(jié)構(gòu)高度保守。一般含有4-16個(gè)串聯(lián)重復(fù)的WD基元，每個(gè)WD基元由40個(gè)氨基酸殘基組成［4］。目前已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、矮牽牛（Petunia hybrida）、石榴（Punica granatum）、桃（Prunus persica）、玉米（Zea mays）、紫蘇（Perilla frutescens）等植物中分離到編碼WD40蛋白的部分基因［5-11］。但是未見牡丹（Paeonia suffruticosa）中WD40基因的相關(guān)研究報(bào)道。本研究利用已構(gòu)建的牡丹花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合RT-PCR技術(shù)，獲得2個(gè)WD40基因PsWD40-1和PsWD40-2的cDNA序列，同時(shí)分析了這2個(gè)基因推定的氨基酸序列及其與其他物種WD40蛋白序列的同源性，為揭示牡丹花青素苷生物合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

牡丹‘洛陽(yáng)紅’（Paeonia suffruticosa‘Luoyang Hong’）1級(jí)［12］花朵取自河南省洛陽(yáng)花木公司牡丹苗圃地，采后運(yùn)回北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院花卉生理和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室。用錫箔紙將花朵中瓣包好后液氮速凍，并保存于- 80℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一鏈合成 采用CTAB法［13］提取牡丹花瓣總RNA。以提取的總RNA為模板，Oligo（dT）15為引物，利用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物回收及測(cè)序 前期本課題組已構(gòu)建牡丹花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，從中篩選出2個(gè)與花青素苷合成有關(guān)的WD40序列Unigene27730和CL7982.Contig1， 分 別 命 名 為PsWD40-1和PsWD40-2。設(shè)計(jì)特異性引物F1（5'-CTTACACACACTGAAACTAAAAAA-3'）和R1（5'-GATAAAGGAAGACATGAAACACA-3'）、F2（5'-CCACATATTAAAAAGAACAAGAGC-3'）和R2（5'-CAAGAAAAAATGAATCCGGG-3'），以合成的cDNA第一鏈為模板分別對(duì)PsWD40-1和PsWD40-2基因的最大閱讀框（Open reading frame，ORF）序列進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系：10 × buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（10 mmol/μL）0.5 μL，上下游引物（10 mmol/μL）各1 μL，cDNA 1 μL，TaqDNA 聚 合 酶（5 U/μL）0.4 μL，ddH2O 18.6 μL。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收，與pGEM-T載體（Promega）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)PCR和酶切鑒定后送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析

測(cè)序獲得的序列通過(guò)NCBI提供的ORF Finder進(jìn)行ORF查找，序列翻譯、氨基酸序列比對(duì)采用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行。通過(guò)ExPASy ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）預(yù)測(cè)所編碼蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)。使用MEGA 5.05軟件中的Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ）法建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因的ORF序列分離

對(duì)本課題組前期構(gòu)建的牡丹‘洛陽(yáng)紅’花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（結(jié)果未發(fā)表）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有65個(gè)Unigene與WD40基因同源性較高（表1）。進(jìn)一步序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Unigene27730和CL7982. Contig1經(jīng)Blastx比對(duì)得到的結(jié)果分別為“WD repeat 2（Vitis vinifera）”和“transparent testa glabra 1（Prunus persica）”，推測(cè)這2個(gè)Unigene序列（分別命名為PsWD40-1和PsWD40-2）可能與參與花青素苷生物合成的WD40蛋白有關(guān)（圖1），利用特異性引物F1和R1、F2和R2分別對(duì)PsWD40-1和PsWD40-2基因ORF序列擴(kuò)增（圖2），獲得預(yù)期大小1 200 bp和1 100 bp左右的條帶。

2.2 牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因核苷酸和推測(cè)所編碼蛋白的分析

測(cè)序結(jié)果（表2）表明，PsWD40-1序列包含一個(gè)1 035 bp的ORF，編碼一個(gè)344 aa的肽鏈，理論分子量為38.78 kD，等電點(diǎn)為4.65；PsWD40-2序列包含一個(gè)1 032 bp的 ORF，編碼一個(gè)343 aa的肽鏈，理論分子量為38.50 kD，等電點(diǎn)為4.95。

牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推測(cè)所編碼蛋白序列對(duì)比結(jié)果顯示2個(gè)蛋白均具有4個(gè)典型的WD40結(jié)構(gòu)域（圖3）；PsWD40-1和PsWD40-2蛋白與葡萄和擬南芥的WD40蛋白間有較高的相似性，

其中PsWD40-1與葡萄VvWDR2相似性為96%，PsWD40-2與葡萄VvWDR1相似性為87%。

2.3 牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因編碼蛋白的同源性分析

PsWD40-1和PsWD40-2蛋白與其他物種WD40蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），進(jìn)化樹總體上分為兩個(gè)分支：TTG1/PAC1和MP1。PsWD40-1與VvWDR2、AtAN11、GhTTG2等序列聚在MP1分支， 而PsWD40-2與VvWDR1、PhAN11、PfWD40等序列聚在另一分支（TTG1/PAC1分支），其中牡丹PsWD40-1與葡萄VvWDR2蛋白同源性最高，牡丹PsWD40-2與葡萄VvWDR1蛋白同源性最高。

3 討論

WD40蛋白序列以N端11-24個(gè)殘基處GH二肽（Gly-His，GH）開始，C末端以WD氨基酸（Trp-Asp，WD）結(jié)尾，因此稱為WD40蛋白［4，10］。最典型WD40蛋白是異源三聚體G蛋白的Gβ亞基，Gβ亞基由7個(gè)扇葉組成的螺旋槳結(jié)構(gòu)，包含7個(gè)WD40基元［3］。這一類古老的蛋白家族結(jié)構(gòu)高度保守，其具有4個(gè)保守WD40結(jié)構(gòu)域，序列在不同植物中也十分保守。本研究分離得到的PsWD40-1和PsWD40-2基因所推測(cè)編碼的蛋白序列也具有WD40蛋白家族典型的4個(gè)保守WD40結(jié)構(gòu)域（圖3），表明牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因?yàn)閃D40類轉(zhuǎn)錄因子基因。

目前，擬南芥WD40蛋白家族研究較為深入。擬南芥WD40類蛋白TTG1調(diào)控多個(gè)植物發(fā)育和生化途徑，其中包括根毛、種皮、莖葉表皮毛的形成和發(fā)育，以及植株花青素苷和原花青素苷的合成與積累等［3，15-18］。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)PsWD40-1和PsWD40-2蛋白分別聚在MP1和TTG1/PAC1分支。TTG1/PAC1分支還包括其他已知在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控花青素的生物合成途徑的WD40蛋白，如葡萄VvWDR1［7］、矮牽牛PhAN11［19］、擬南芥AtTTG1［3］、紫蘇PfWD40［8］、玉米ZmPAC1［9］等，推測(cè)PsWD40-2基因可能參與調(diào)控牡丹花青素的生物合成。而與牡丹PsWD40-1蛋白同源性最高的葡萄VvWDR2，在擬南芥中異源表達(dá)并未提高轉(zhuǎn)基因擬南芥花青素苷含量［7］。因此PsWD40-1和PsWD40-2基因是否在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控牡丹花青素的生物合成，其生物學(xué)功能的揭示需要進(jìn)一步開展大量研究工作。

4 結(jié)論

本研究利用已構(gòu)建的牡丹花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合RT-PCR技術(shù)，獲得2個(gè)WD40基因PsWD40-1和PsWD40-2的cDNA序 列。 牡 丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推測(cè)所編碼蛋白序列均具有WD40蛋白家族典型的4個(gè)保守WD40結(jié)構(gòu)域。PsWD40-1和PsWD40-2蛋白序列與其他物種調(diào)控花青素苷合成相關(guān)WD40蛋白同源性較高。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Isolation and Sequence Analysis of the Paeonia suffruticosa WD40 Transcription Factor Genes PsWD40-1 and PsWD40-2

Zhang Chao Gao Shulin Du Danni Wu Fan Dong Li
（College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，National Flower Engineering Technology Research Center，Beijing 100083）

Two Unigene sequences that share high homology with WD40 protein involved in plant anthocyanin biosynthesis were obtained from previous-constructed tree peony（Paeonia suffruticosa ‘Luoyang Hong’）petal transcriptome database and named as PsWD40-1 and PsWD40-2. Sequences of open reading frame（ORF）in PsWD40-1 and PsWD40-2 were amplified with designed specific primers using RTPCR technology and sequenced. Results showed that PsWD40-1 contains a 1 035 bp ORF encoding 344 amino acid residues, and PsWD40-2 contains a 1 032 bp ORF encoding 343 amino acid residues. The predicted protein sequences of PsWD40-1 and PsWD40-2 genes both contain the typical WD40 structural domain. PsWD40-1 shares high similarity（96%）with VvWDR2 of Vitis vinifera, and PsWD40-2 shares 87% similarity with VvWDR1 of Vitis vinifera. Phylogenetic tree analysis showed that PsWD40-1 is grouped into the MP1 clade with VvWDR2 of Vitis vinifera, AtAN11 of Arabidopsis thaliana, and GhTTG2 of Gossypium hirsutum, while PsWD40-2 is grouped into the other clade, TTG1/PAC1 clade, with VvWDR1 of Vitis vinifera, PhAN11 of Petunia hybrida, and PfWD40 of Perilla frutescens.

Tree peony （Paeonia suffruticosa） Anthocyanin biosynthesis Regulatory gene WD40 protein

2013-09-09

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20130014110014）

張超，男，博士研究生，研究方向：牡丹切花花色發(fā)育；E-mail：zhangchao24804@gmail.com

董麗，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：鮮切花采后保鮮；E-mail：dongli@bjfu.edu.cn