付瑜華 盧加舉 李向勇

（貴州省亞熱帶作物研究所，興義 562400）

甘蔗主要病害抗病遺傳育種研究進展

付瑜華 盧加舉 李向勇

（貴州省亞熱帶作物研究所，興義 562400）

甘蔗生產(chǎn)長期受到病害的嚴重影響，這些病害不僅降低蔗莖產(chǎn)量和糖分，還影響宿根性，甚至造成品種種性退化，而抗病品種的選育是保證甘蔗生產(chǎn)的有效途徑。概述了甘蔗花葉病、黑穗病、宿根矮化病和梢腐病4種主要甘蔗病害在病原物檢測、種質(zhì)篩選和基因工程技術(shù)等抗病育種工作方面的研究進展。

抗病育種 花葉病 黑穗病 宿根矮化病 梢腐病

甘蔗是我國乃至世界重要的糖料作物和理想的能源植物，甘蔗產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展對蔗農(nóng)增收和國家能源安全保障具有重要意義。然而，在甘蔗生長過程中會遭遇甘蔗花葉病、黑穗病、宿根矮化病和梢腐病等病害的侵染，不僅甘蔗品質(zhì)和產(chǎn)量受到嚴重影響，還縮短宿根年限，甚至造成品種種性退化，甘蔗病害已經(jīng)成為制約我國甘蔗生產(chǎn)的一個重要因素。因此，提高甘蔗的抗病性是甘蔗育種的重要目標之一，選育抗病雜交種，對于保證甘蔗高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)有著現(xiàn)實意義，現(xiàn)對甘蔗4種主要病害在抗病育種研究方面的工作進展進行概述。

1 花葉病

甘蔗花葉病在世界幾大蔗區(qū)均有發(fā)生［1］，我國臺、閩、粵、桂、浙、滇等蔗區(qū)的花葉病發(fā)生較為普遍和嚴重［2］。該病為傳播性的病毒病，對甘蔗、玉米、高粱、小麥和大麥等農(nóng)作物危害嚴重，病原物為甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）、高 粱 花 葉 病 毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）、約翰遜草花葉病毒（Johnsongrass mosaic virus，JGMV）、玉米矮花葉病毒（Maize dwarf mosaic virus，MDMV）、玉米花葉病毒（Maize mosaic virus，MMV）和甘蔗線條花葉病毒（Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV），除SCSMV為馬鈴薯Y病毒科的一個新屬代表外，其他均為馬鈴薯Y病毒屬成員［3-8］。甘蔗花葉病病毒粒體呈線狀或桿狀，基因組為單鏈正義RNA，大小約10 kb。病毒粒子通過破壞甘蔗葉片細胞內(nèi)葉綠體，使葉組織發(fā)生透綠現(xiàn)象，阻礙了光合作用，造成病株節(jié)間變短，品質(zhì)變差，若感病植株作為蔗種，則萌芽率降低。

甘蔗存在天然的SCMV抗性品種，通過采用抗病性強的品種作為親本育種或生產(chǎn)，可有效控制花葉病對甘蔗產(chǎn)業(yè)的危害，因此各國科學(xué)家對花葉病抗性材料的獲得進行了大量的研究。李文鳳等［9］采用甘蔗生長期切莖接種法對國家甘蔗種質(zhì)資源圃保存的32份優(yōu)良品種材料進行抗花葉病鑒定，獲得11個免疫材料和7個抗性材料。Li等［10］利用RTPCR技術(shù)對云南甘蔗種質(zhì)資源圃中的70個甘蔗野生種質(zhì)進行抗SrMV種質(zhì)的鑒定，獲得39個對SrMV具有高抗或中抗的種質(zhì)。Zambrano等［11］通過對易感品種B6749進行輻射誘變，不僅獲得了15個抗SCMV甘蔗材料，還得到一條與SCMV抗性相關(guān)的854 bp大小的條帶。目前的研究表明，我國高抗SCMV的糖蔗品種主要為桂糖11、閩糖70-611和福引79-9，而生產(chǎn)上推廣的果蔗品種則多數(shù)為不抗SCMV。

1994年，澳大利亞科學(xué)家Smith等［12］首次采用基因槍轟擊的方法將甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因轉(zhuǎn)化到甘蔗的莖分生組織，試圖通過基因工程的手段獲得抗病植株。隨后，Ivan等［13］將高粱花葉病毒CP基因分別轉(zhuǎn)入甘蔗CP65-357和CP72-1210，篩選出的轉(zhuǎn)基因植株在大田中出現(xiàn)感病、恢復(fù)型和免疫型3種表型。姚偉等［14］將甘蔗花葉病毒SCMV-D株系的外殼蛋白基因通過基因槍轟擊導(dǎo)入果蔗Badila中，獲得53株抗性轉(zhuǎn)化苗，在轉(zhuǎn)基因材料中間試驗和環(huán)境釋放試驗中，轉(zhuǎn)CP基因的甘蔗表現(xiàn)出較強的抗病能力，同時甘蔗的產(chǎn)量和糖分也得到了提高。郭鶯等［15］將甘蔗花葉病病毒E株系的外殼蛋白基因CP轉(zhuǎn)入果蔗Badila后出現(xiàn)類似的結(jié)果。RNAi是雙鏈RNA介導(dǎo)的特異性基因沉默現(xiàn)象，利用較小的片段（60-200 bp）即可誘導(dǎo)，不僅便于植物表達載體的構(gòu)建，而且使創(chuàng)造多病毒的抗性成為可能。肖淑惠等［16］利用RNAi策略，構(gòu)建了可同時誘導(dǎo)SCMV、SrMV和SCYLV三種病毒基因沉默的多價抗病毒基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘蔗胚性愈傷組織，以期獲得具有廣譜抗病性的轉(zhuǎn)基因甘蔗植株。福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗研究所進一步對抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的食品安全、土壤生態(tài)安全、基因飄移、病毒的異源包裝和重組、轉(zhuǎn)基因雜草化等方面做了詳細的調(diào)查研究［17］。雖然我國在甘蔗抗花葉病種質(zhì)選育和分子育種方面取得了一定的成績，但由于花葉病毒不同株系高頻率的復(fù)合侵染、新病毒株系的出現(xiàn)，病毒株系間遺傳重組等情況的發(fā)生，使花葉病毒仍嚴重威脅著甘蔗產(chǎn)業(yè)［18］。

2 宿根矮化病

甘蔗宿根矮化?。≧atoon stunting disease，RSD）是甘蔗主要病害之一，嚴重影響甘蔗種植。RSD主要通過阻礙木質(zhì)部輸導(dǎo)組織對水肥的運輸，造成甘蔗水肥不足，植株矮化、生長緩慢。RSD的病原菌為一種寄居木質(zhì)部的細菌Leifsonia xyli subsp.xyli（Lxx）［19］，該病首先在澳大利亞昆士蘭州甘蔗品種Q28中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已廣泛發(fā)生于世界各植蔗國和地區(qū)，該病也是導(dǎo)致我國甘蔗宿根蔗產(chǎn)量低、品質(zhì)差的主要原因之一。目前主要采用將蔗種浸泡于50℃熱水中2 h的方法來控制RSD的發(fā)病率，該方法不僅可以消除90%的RSD病原菌，同時也有利于芽點的萌發(fā)和產(chǎn)量的提高［20-22］。對RSD常用的檢測手段主要為酶免疫方法和PCR技術(shù)［23，24］。Liu等［25］研發(fā)出了利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)對甘蔗RSD檢測的手段，不需要PCR和電泳檢測，通過觀測即可快速靈敏的檢測甘蔗Lxx，將針對Lxx特異片段設(shè)計的4對引物（各0.2 μmol/L F3和B3，各0.8 μ mol/L FIP和BIP）、8 U Bst DNA聚合酶、1.4 mmol/L dNTP、10 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L（NH4）2SO4、5.57 mmol/L MgSO4、0.1%Triton X-100和蔗汁DNA混合成25 μL體系，65℃水域60 min后80℃水域2 min終止反應(yīng)，加入適量SYBR Green I，擴增體系顏色變?yōu)辄S綠色表示蔗汁DNA含有Lxx，橙色表示蔗汁DNA未感病。

甘蔗宿根矮化病的抗病育種研究進展緩慢，主要在篩選抗甘蔗RSD的種質(zhì)資源方面做了較多的研究。Roach和Jackson［26］通過對甘蔗人工接種RSD病菌，觀察18個甘蔗品系連續(xù)4年對RSD的抗性表現(xiàn)，結(jié)果表明，L6025的抗性最好。同時，Roach又對325份甘蔗材料進行了RSD抗性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大莖野生種和熱帶種有相似的RSD發(fā)病率，而印度種、中國種和甘蔗屬近緣植物斑茅則具有較高的RSD發(fā)病率［26，27］。Comstock等［28］通過組織印記免疫法對美國弗羅里達州的甘蔗材料進行抗RSD種質(zhì)掃描發(fā)現(xiàn)，1989年后培育的CP系列抗性表現(xiàn)良好，而我國張妍等［29］采用浸蔗種法對6個系列100份甘蔗品種進行侵染，計算各品種RSD發(fā)病率，對甘蔗種質(zhì)資源進行抗性評價，結(jié)果表明CP系列的抗性較強，可作為抗RSD的育種材料。目前，甘蔗宿根矮化病CTCB07株系的全基因組測序已經(jīng)完成［30］，為揭示Lxx的致病機理提供了新的機遇，對利用基因工程手段進行甘蔗RSD的防治具有重要意義。

3 黑穗病

甘蔗黑穗病（Sugarcane smut）是一種真菌型甘蔗病害，病原甘蔗鞭黑粉菌（Ustilago scitamineaSyd.）有多個生理小種分化現(xiàn)象，通常采用鑒別寄主的方法對甘蔗黑穗病菌生理小種進行劃分，我國目前發(fā)現(xiàn)兩個小種，即小種1和小種2［31，32］。在世界各地蔗區(qū)均有發(fā)生，不僅造成甘蔗產(chǎn)量損失，還使蔗糖糖分降低，影響品質(zhì)。世界幾個主產(chǎn)蔗國和地區(qū)把甘蔗無性系對黑穗病的抗性作為品種選擇的一個主要目標，在育種的不同生理時期，分別采用自然侵染法和人工接種法來淘汰感病株。澳大利亞采用丙環(huán)唑和三唑酮處理甘蔗種莖來有效預(yù)防黑穗病的發(fā)生，Bharathi和Shamsul等［33，34］檢測了9種殺菌劑對黑穗病孢子萌芽抑制情況，并將接種了黑穗病病原菌的蔗種浸泡在殺菌劑懸浮液中后種植于大田發(fā)現(xiàn)，植后6個月或9個月的甘蔗出現(xiàn)感染黑穗病現(xiàn)象。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用PCR方法檢測甘蔗黑穗病菌存在與否的研究也有報道［35］。Shen等［36］開發(fā)了一種巢式PCR技術(shù)，能夠靈敏可靠檢測至200 fg的真菌基因組DNA，為甘蔗黑穗病病菌的檢疫和無毒種莖生產(chǎn)提供了分子檢測手段。

通過了解不同蔗區(qū)黑穗病病原分離物的遺傳分化情況，可以為黑穗病抗性鑒定中病原菌的選擇提供理論依據(jù)。Luzaran等［37］對菲律賓17個蔗區(qū)的96個甘蔗黑穗病病原菌進行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示該96個病原菌可聚為A、B、C三類。闕友雄等［38］對我國6個重要甘蔗生產(chǎn)區(qū)的甘蔗黑穗病菌進行了RAPD和SRAP分析，聚類結(jié)果表明甘蔗黑穗病菌分子多樣性同地理來源有一定的相關(guān)性，但與寄主來源無關(guān)［38，39］。為了發(fā)掘與黑穗病抗性相關(guān)的分子標記，許莉萍等［40］將抗病品種Co1001和感病品種Ya71-374雜交構(gòu)建抗病性分離群體，借助RAPD和集群分離分析法獲得了一個與抗病基因連鎖的520 bp片段。另外，Meredith等［41］將與甘蔗黑穗病連鎖的3個AFLP標記通過染色體步移和測序的方法將其分別轉(zhuǎn)化成了酶切擴增多態(tài)性標記（CAPS）、SCAR標記和SNP標記。Que等［42］用cDNA-AFLP的方法檢測抗病甘蔗基因型在黑穗病病菌侵染后的表達基因，獲得40個TDFs，推測其中28個TDFs在甘蔗抵御黑穗病病菌侵染過程中起作用。Chen等［43］克隆了甘蔗NPR1基因（ScNPR1）并發(fā)現(xiàn)其在黑穗病菌侵染后的甘蔗葉片和葉鞘中表達量升高，因此認為ScNPR1基因在甘蔗抵御黑穗病菌侵染的過程中起作用。Dalvi等［44］將CoC671愈傷組織進行EMS誘變并對310個體細胞無性系進行溫室和大田篩選，不僅獲得抗甘蔗黑穗病的TC906和TC922，且二者在單莖重、產(chǎn)量和莖徑粗方面均優(yōu)于CoC 671。

4 梢腐病

甘蔗梢腐?。≒okkah boeng disease，PBD）是由鐮刀菌（Fusarium moniliformae）引起的一種真菌型甘蔗病害，1921年在爪哇首次發(fā)現(xiàn)，至今該病在所有甘蔗生產(chǎn)國均有發(fā)生［45］。我國廣西甘蔗梢腐病的發(fā)病率近年來有所增加，尤其對新臺糖系列品種的危害嚴重［46］。甘蔗伸長期是梢腐病的主要發(fā)生時期，Debahuti等［47］研究表明，鼠李糖脂表面活性劑可有效防治Fusarium sacchari的致病性。Lin等［48］將G.fujikuroi接種到果蔗福安，分別在0 h和48 h提取葉片蛋白，確定了24個差異蛋白點，其中10個蛋白與抗病性相關(guān)，進一步的生理生化和實時熒光定量PCR分析，初步揭示了果蔗與梢腐病病原菌G.fujikuroi之間互作的分子機制，為果蔗的抗病育種奠定了理論基礎(chǔ)。

危害甘蔗的主要病害除以上描述的4種外，還有黃葉病、斐濟病、鳳梨病、褐條病和赤腐病等，其中黃葉病是新發(fā)生的一種世界性病毒病，甘蔗屬中的割手密和印度種對黃葉病有一定的抗性［49］。不同類型病害對甘蔗蔗莖蔗糖分的影響程度主要取決于甘蔗品種和環(huán)境條件，藥劑防治雖然可以有效控制多數(shù)病害、保證作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，但防治病害最為經(jīng)濟有效的措施是抗病品種的選育。

5 結(jié)語

分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，為培育抗性持久穩(wěn)定的甘蔗品種提供了分子育種手段和巨大的發(fā)展空間。植物抗細菌和真菌病害基因工程的育種策略分別是基于寄主-病原菌相互識別及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系的基因工程和基于抗菌蛋白的基因工程。利用外殼蛋白基因、復(fù)制酶基因等病毒來源基因介導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性是植物抗病毒基因工程應(yīng)用較多的一種策略，但存在一定的局限性［50，51］。RNA干擾介導(dǎo)的植物抗病毒技術(shù)可強化植物體內(nèi)天然的RNA沉默抗病毒能力，具有高效和特異性，在植物抗病毒研究中表現(xiàn)出極大潛力［52］。除甘蔗抗花葉病基因工程研究較多之外，其他3種甘蔗病害的抗病基因工程研究還處于起步階段，但隨著植物與病原物相互作用機制研究的深入和RNA干擾技術(shù)的日趨完善，必將推進甘蔗抗病育種的進程。同時，應(yīng)建立轉(zhuǎn)基因抗病甘蔗安全性評價技術(shù)體系，構(gòu)建嚴謹?shù)娘L(fēng)險評估試驗設(shè)計，為抗病轉(zhuǎn)基因甘蔗商業(yè)化種植提供科學(xué)的生態(tài)風(fēng)險評估體系，從而進一步促進糖料事業(yè)的發(fā)展。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Progress on Disease-resistant Breeding of Major Diseases in Sugarcane

Fu Yuhua Lu Jiaju Li Xiangyong
（Guizhou Institute of Subtropics Crops，Xingyi 562400）

Sugarcane production has been severely affected by diseases, which not only cause losses of yield and sugar content but also affect perennial root and even cause variety degeneration. Cultivating disease-resistant variety is the economic and effective way to ensure sugarcane production. The progress on disease-resistant breeding including pathogen detection, germplasm screening and genetic engineering of sugarcane mosaic disease, sugarcane smut, ratoon stunting disease and pokkah boeng disease were discussed.

Sugarcane disease-resistant breeding Sugarcane mosaic disease Sugarcane smut Ratoon stunting disease Pokkah boeng disease

2013-09-06

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目［黔科合J字（2012）2253號］

付瑜華，女，博士，助理研究員，研究方向：甘蔗基因工程和分子遺傳育種；E-mail：fufu6699@aliyun.com