王立強 綜述，王洪軍 審校

沈陽軍區(qū)聯(lián)勤部 疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110034

預(yù)防控制病毒性傳染病的關(guān)鍵技術(shù)是研制免疫原性強和免疫途徑生物利用率高的有效疫苗。目前，已納入國家計劃免疫的疫苗，除少數(shù)為口服外，多數(shù)以針劑注射為主，而注射疫苗抗原用量大，針頭為潛在的感染源。相比之下，通過鼻黏膜給藥更符合原位免疫設(shè)計理念，它可以將病毒控制在感染的起始階段，具有刺激局部黏膜免疫，帶動機體系統(tǒng)免疫的優(yōu)點。氣溶膠疫苗抗原對黏膜淋巴組織的刺激是產(chǎn)生分泌性IgG的必要條件，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生早期、高效和持久的免疫應(yīng)答，形成較長時間的抗病毒狀態(tài)。因此，鼻黏膜免疫載體和傳遞系統(tǒng)是氣溶膠疫苗鼻腔黏膜免疫策略成功的關(guān)鍵。

1 鼻腔給藥特點

鼻腔作為給藥部位具有以下生物學(xué)特征：①促進藥物吸收：鼻腔黏膜上有很多細微絨毛，上皮細胞下有豐富的毛細血管和淋巴管，增加了藥物吸收的有效面積，使藥物容易通過鼻黏膜吸收；②避免肝臟的首過效應(yīng)和胃腸道酶的降解：藥物經(jīng)鼻黏膜吸收后直接進入體循環(huán)，提高了藥物的生物利用度；③給藥方便：以滴入或噴入方式給藥，患者可自行完成。但鼻黏膜絨毛的另一個生理特點是，任何粉末或顆粒在鼻腔的總接觸時間是20～30 min，鼻黏膜上的黏液被纖毛以5～6 mm/min的速度迅速清除[1]。為了解決鼻黏膜免疫的局限性，現(xiàn)已應(yīng)用近年發(fā)展的可降解生物材料脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物和殼聚糖等緩釋或控釋微顆粒來延長疫苗在鼻腔內(nèi)的滯留時間及滯留量，達到提高有效生物利用度的目的。

2 鼻黏膜免疫

傳統(tǒng)的免疫途徑為注射給藥，機體生理順應(yīng)性差，亦有引起返祖現(xiàn)象。鼻腔黏膜免疫是一種非侵入性疫苗接種途徑。鼻腔中的酶活性相對較低，可以保護疫苗不受酶的降解。據(jù)報道，與口服疫苗相比，抗原經(jīng)鼻黏膜免疫的劑量為口服免疫劑量的1/4，但仍可在血清及黏液中誘導(dǎo)強有力的抗原特異性抗體反應(yīng)，鼻黏膜免疫不僅可以誘導(dǎo)產(chǎn)生全身性IgG抗體反應(yīng)，還可以產(chǎn)生黏膜IgA抗體反應(yīng)，最終形成兩道防御體系來共同保護機體免受傳染性疾病病原的侵害[2]。鼻腔中含有豐富的樹突狀細胞，可以介導(dǎo)強大的全身性及黏膜免疫反應(yīng)，可以防御各種抗原及病原體通過呼吸系統(tǒng)對機體的侵害。鼻黏膜免疫可在唾液腺及生殖道中產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)，表明刺激后的淋巴細胞遷移到了共同黏膜免疫系統(tǒng)的特異性效應(yīng)因子位點，這符合黏膜特異性淋巴細胞歸巢的理論[3]。

3 鼻黏膜免疫載體

脂質(zhì)體（liposome）、免疫刺激復(fù)合物（immune stimulating complexes，ISCOM）和殼聚糖（chitosan，CS）是近年發(fā)展的黏膜免疫載體。

3.1 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由同心脂質(zhì)雙分子層包圍一個水核形成的球形小囊，可以攜帶脂溶性和水溶性的抗原，主要由磷脂和膽固醇組成[4]。脂質(zhì)體作為一種新型疫苗載體，具有許多生物學(xué)特點：①增強抗原透入細胞的能力，能將目的抗原特異傳遞到靶細胞中，無毒無免疫原性，減少了疫苗對鼻黏膜的毒性和刺激性[5]；②穩(wěn)定抗原，防止疫苗抗原被黏膜上的酶類降解而失活，使黏膜免疫部位保持高的疫苗濃度[6]；③包被脂質(zhì)體的抗原可長期在吞噬細胞和抗原提呈細胞中存在，持續(xù)釋放被包封疫苗，形成長效緩釋作用[7]；④脂質(zhì)體作為鼻黏膜免疫佐劑具有生物黏附特性，膜表面帶負電荷比帶正電荷的脂質(zhì)體有更強的誘導(dǎo)抗體形成的能力，膜表面帶有抗原的脂質(zhì)體載體的作用比膜內(nèi)帶有抗原的脂質(zhì)體載體更強；特別是帶正電荷的脂質(zhì)體生物黏附性較強，能減少疫苗被黏膜纖毛的清除，使疫苗較長時間保持有效血藥濃度，提高生物利用度[8]；⑤可作為鼻黏膜免疫載體，刺激機體的黏膜和全身免疫應(yīng)答反應(yīng)；⑥具有生物低密度，可生物降解，易于制備，使用方便。脂質(zhì)體發(fā)揮佐劑作用不受其與抗原連接形式的影響，只須將兩者簡單混合即可[9-10]。

多種病毒抗原包入脂質(zhì)體內(nèi)可以用于鼻腔黏膜接種。此外，將變應(yīng)原包入脂質(zhì)體內(nèi)鼻腔給藥，還可抑制特異性IgE抗體反應(yīng)，從而阻止吸入或食入抗原時引起的變態(tài)反應(yīng)。Childers等[11]首次以人體為對象，研究了鼻內(nèi)接種脂質(zhì)體-蛋白菌苗后引起的免疫反應(yīng)。所用抗原系富含葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的變異鏈球菌粗制抗原制劑（C-GTF）。受試者鼻內(nèi)接種包被C-GTF的脂質(zhì)體后，鼻洗液中特異性抗C-GTF IgA水平有所提高，誘生的唾液特異性IgM和IgA2水平提高程度較低，血清中IgM和IgA水平也有增加。通過進一步比較鼻內(nèi)接種包被C-GTF的脂質(zhì)體后誘生的免疫應(yīng)答與單純C-GTF誘生的免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體-抗原組中只有鼻洗液特異性IgA1應(yīng)答顯著強于單純抗原組，提示脂質(zhì)體可影響局部黏膜免疫應(yīng)答的強度，而不影響全身應(yīng)答反應(yīng)。

脂質(zhì)體作為氣霧疫苗載體，其安全性日益受到關(guān)注。小鼠和人體實驗結(jié)果均表明，脂質(zhì)體鼻腔給藥是安全的。賴氨匹林脂質(zhì)體家兔鼻腔給藥[12]，20 d后處死，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)鼻黏膜血管無病理改變，纖毛完好，組織無出血或炎細胞浸潤；而給予水溶液的對照組，鼻黏膜血管有輕度損害，纖毛卷曲，有少許炎細胞浸潤。脂質(zhì)體作為載體存在的問題是：①脂質(zhì)體的尾部脂肪酸易被氧化，影響其穩(wěn)定性；②小脂質(zhì)體囊相互融合成大脂質(zhì)體，易破壞脂質(zhì)體膜；③批間差異較大。

3.2 免疫刺激復(fù)合物

ISCOM是一類以脂質(zhì)（lipid）、皂素（saponin）為主的復(fù)合型佐劑。在ISCOM基質(zhì)中，皂素分子Quil A結(jié)合于固醇類和磷脂酰膽堿，可形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其直徑為30～40 nm，能夠與抗原疏水部分結(jié)合，從而將其親水面暴露于免疫細胞[13]。

ISCOM是Morein于1984年發(fā)現(xiàn)的一種新的疫苗輸送系統(tǒng)[14]。其作用機制是，捕獲大量抗原分子并釋放給抗原提呈細胞，刺激B細胞反應(yīng)，增加抗體產(chǎn)生，誘導(dǎo)T細胞反應(yīng)，刺激產(chǎn)生CD4+、CD8+T淋巴細胞和細胞因子IL-12，促進MHC分子的表達，促進CTL活性和細胞免疫[15]。ISCOM也可以促進病毒蛋白的攝取、加工和呈遞給特異性CD8+T淋巴細胞，但在鼻腔內(nèi)上皮細胞不能攝取ISCOM-Matrix投遞的抗原，暗示鼻內(nèi)免疫時，上皮細胞不能被特異性細胞毒性T細胞識別并殺死[16]。其優(yōu)點是能夠快速、有效地將抗原提呈給免疫系統(tǒng)，可在免疫后迅速激活機體的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答效果。其復(fù)合疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，疫苗抗原的需求量減少至1/10～1/2[17]，能夠增加抗體反應(yīng)水平和持久性，也能產(chǎn)生強的細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。而且，復(fù)合形成的蛋白抗原性與游離形式的溶液相比穩(wěn)定性增強。IS?COM疫苗的穩(wěn)定性極好，能被冷凍、凍干，并能溶解于多種緩沖液中，有利于疫苗的保存、貯藏。

ISCOM作為疫苗載體能夠發(fā)揮免疫佐劑作用：①能夠引發(fā)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類CTL反應(yīng)，平衡Th1和Th2反應(yīng)，產(chǎn)生包括所有同型和亞型的抗體反應(yīng)，增強長期的記憶反應(yīng)[18]，具有免疫調(diào)節(jié)作用；②誘導(dǎo)IL-2、IFN-γ、IL-12等多種細胞因子，細胞因子之間具有相互激發(fā)誘導(dǎo)連鎖反應(yīng)作用[19]；③可以黏附用藥，滿足黏膜輸送系統(tǒng)的要求；鼻腔接種或口服后能引起多種反應(yīng)，包括遠端的腸道、生殖道的黏膜反應(yīng)；④能更有效地遞呈抗原，適于各年齡段人員免疫；⑤ISCOM包含的抗原可以是一種病毒的包膜蛋白、細胞膜蛋白或含疏水區(qū)的任何抗原；非疏水性抗原可以加入疏水的尾部，或通過酸處理暴露隱藏的疏水區(qū)再整合到ISCOM中[20]，因此能在相對長的時間內(nèi)起作用。

自1984年Morein等公布ISCOM技術(shù)后，這一新的佐劑系統(tǒng)已在多種疫苗中得到應(yīng)用。馬流感病毒和ISCOM整合疫苗已于1989年在瑞典上市，并沒有嚴重副反應(yīng)。人用疫苗目前僅Flu-ISCOM進入臨床試驗，其Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗已完成，期待這種新的技術(shù)能給傳統(tǒng)的疫苗帶來變革。將含有ISCOM的疫苗注射接種后，T細胞應(yīng)答首先在引流淋巴結(jié)中被檢測到，接種50 d后，在骨髓中也有大量抗體產(chǎn)生細胞[21]，由于抗原提呈細胞的內(nèi)體小泡和泡質(zhì)溶膠的雙重作用，含ISCOM的疫苗可以通過MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ兩種途徑將抗原提呈給免疫系統(tǒng)，同時激活CD4+和CD8+T淋巴細胞[22]。含ISCOM的疫苗的另一個優(yōu)點是可以經(jīng)口服或鼻腔接種獲得免疫，且能達到在局部和全身黏膜表面誘導(dǎo)有效和特異的黏膜免疫應(yīng)答。小鼠鼻腔接種流感ISCOM疫苗后，可誘導(dǎo)堅強的黏膜抗體和CTL應(yīng)答反應(yīng)，并可抵抗攻擊感染。氣霧ISCOM疫苗除了可以引發(fā)MHC-Ⅰ介導(dǎo)的CTL活性外，還有全身性免疫應(yīng)答，包括特異抗體、分泌型IgA、CD8+T細胞應(yīng)答等[23]。重復(fù)低劑量氣霧免疫ISCOM疫苗不會引起免疫耐受[24]。

ISCOM在使用上也存在一些限制性因素。它并非可以和任何抗原都能形成復(fù)合體[25]，只有那些含疏水基團很多的抗原或免疫原才能與ISCOM形成復(fù)合體，含親水基團多的抗原（免疫原）不適合與IS?COM佐劑混合制備疫苗。

3.3 殼聚糖

殼聚糖是帶陽電荷的線性多糖，是一種生物粘性物質(zhì)，由殼質(zhì)所產(chǎn)生，存在于甲殼類的殼中，通過脫乙酰作用而形成，可有一系列的脫乙酰程度和不同的相對分子質(zhì)量。殼聚糖谷氨酸鹽的平均相對分子質(zhì)量約為250×103，脫乙酰程度為80%以上，水溶性（pH6.5），在單一的殼聚糖溶液組方時，其生物利用度可增加5～6倍[26]。殼聚糖又是一種天然聚多糖，有良好的生物相容性和生物可降解性，其分子中的葡糖胺基荷正電，與荷負電的DNA可產(chǎn)生靜電作用，凝聚為多聚復(fù)合物[27]，這種納米粒子可以克服疫苗經(jīng)黏膜吸收的生理學(xué)屏障，通過細胞內(nèi)吞途徑，抵達黏膜下淋巴組織，能夠與鼻上皮細胞及其黏液層起強烈作用，以保證在被黏膜纖毛清除之前使疫苗通過鼻黏膜[28]。殼聚糖還可以通過上皮細胞之間緊密連接處的暫時開放而增加極性疫苗細胞旁路搬運的能力。實驗證明，殼聚糖遞送系統(tǒng)可明顯增強流感疫苗在小白鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)。殼聚糖納米粒比溶液制劑更有效地促進黏膜對疫苗的吸收，增強機體對疫苗的免疫反應(yīng)[29]。

殼聚糖是自然界中惟一含游離氨基堿性基團的可食性動物纖維，殼聚糖作為黏膜疫苗載體，具有良好的生物相溶性、低毒性及促滲作用[30]，在鼻黏膜免疫領(lǐng)域倍受關(guān)注，它能與活體組織相容，被體內(nèi)的溶菌酶、胃蛋白酶降解后，降解產(chǎn)物能完全被人體吸收，無毒、無副作用。殼聚糖還具有良好的凝結(jié)能力和免疫刺激活性。研究證明，與普通的水溶性流感疫苗相比，含有可溶性殼聚糖的流感疫苗能促進小鼠體內(nèi)血凝抑制抗體的產(chǎn)生[31]?；谏鲜錾锾匦?，殼聚糖在黏膜免疫中得到了廣泛應(yīng)用。殼聚糖作為黏膜疫苗載體的作用機制表現(xiàn)如下：①黏膜吸附特性：殼聚糖分子中的羥基、氨基可與黏膜粘液中帶負電荷的糖蛋白形成氫鍵而產(chǎn)生黏附作用，延緩抗原的清除，使其有更多的時間與黏膜接觸，使抗原易穿過黏膜屏障，與黏膜下的淋巴組織發(fā)生作用；殼聚糖的黏膜吸附性能誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，與小腸中下游黏膜之間的黏附性，能夠加強它與腸腔表面的緊密接觸，有利于微球繼續(xù)向集合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)運，進而引起全身及黏膜免疫反應(yīng)[32]；②促滲作用：殼聚糖可使黏膜上皮細胞緊密結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而開放跨膜通道，提高黏膜通透性，促蛋白抗原大分子的跨黏膜吸收；用殼聚糖及其衍生物作用于細胞單層，可引起跨上皮細胞電阻降低，促進疫苗抗原順利通過細胞旁路進入體內(nèi)，增強疫苗的滲透吸收，提高抗原的生物利用度[33]；③殼聚糖在黏膜免疫中的佐劑效應(yīng)：疫苗經(jīng)鼻黏膜免疫產(chǎn)生的免疫反應(yīng)常不能達到理想的免疫效果，故須依賴一些有效的黏膜免疫佐劑和載體系統(tǒng)，而殼聚糖能夠提高巨噬細胞、T細胞、漿細胞、B細胞、嗜酸性粒細胞及多形核細胞的活性和積聚能力，阻止病原微生物的侵入和定居，誘導(dǎo)細胞因子如IFN-γ、IL-4等的產(chǎn)生，激發(fā)有效的T細胞免疫應(yīng)答，中和細菌毒素，增強遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和細胞毒性T細胞反應(yīng)。殼聚糖自身還可引起IL-10釋放及黏膜IL-4的表達，并激活脾臟的CD4+T細胞，明顯上調(diào)黏膜Th2免疫反應(yīng)，巨噬細胞攝取殼聚糖后即可活化[34]。殼聚糖的這種非特異免疫佐劑作用與其脫乙?；潭群蛣┬陀嘘P(guān)，脫乙?；潭雀叩目扇苄詺ぞ厶腔钚暂^弱，而顆粒狀殼聚糖更易誘導(dǎo)巨噬細胞的吞噬作用[35]。殼聚糖可有效促進局部（特別是黏膜局部）的免疫反應(yīng)，增強抗原傳遞系統(tǒng)功能，具有免疫佐劑和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。

4 結(jié)語

綜上所述，脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物和殼聚糖作為新型鼻黏膜免疫載體或佐劑，為鼻腔黏膜途徑給藥開拓了更為廣闊的應(yīng)用前景。目前脂質(zhì)體尚存在不夠穩(wěn)定等缺點，給長期貯存及用藥帶來不便。應(yīng)結(jié)合鼻腔黏膜的生理結(jié)構(gòu)特點來綜合考慮脂質(zhì)體的粒徑大小、表面電荷和制備方法等因素，以達到最佳應(yīng)用效果。免疫刺激復(fù)合物佐劑是適合所有疫苗的通用免疫調(diào)解技術(shù)平臺，它能夠刺激機體對常規(guī)疫苗用量1/10的抗原產(chǎn)生相同或更強的抗體和細胞免疫反應(yīng)，而且這種反應(yīng)持續(xù)時間長，未見過敏反應(yīng)或其他嚴重毒害事件發(fā)生的報道。以ISCOM為載體的抗宮頸癌疫苗和高效低毒流感疫苗已進行Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗，市場潛力巨大。殼聚糖是天然來源的多糖類陽離子高分子材料，來源廣泛，納米微粒、微球制備工藝簡單，不需有機溶劑，有利于疫苗的穩(wěn)定。目前水溶性殼聚糖品種不多，一般需要溶解于醋酸等弱酸溶液中，由于pH值較低，DNA疫苗容易在制備過程中降解，因而開發(fā)和采用水溶性好的殼聚糖衍生物是十分必要的。隨著研究的深入和新劑型的開發(fā)，殼聚糖納米載體和PEG交聯(lián)殼聚糖季銨鹽水凝膠作為佐劑和載體，將會在黏膜免疫產(chǎn)業(yè)化進程中發(fā)揮重要作用[25]。因此，新型鼻黏膜疫苗的開發(fā)，主要通過鼻黏膜表面抗原呈遞系統(tǒng)的改進來實現(xiàn)。國外科學(xué)家已將痘病毒氣霧疫苗成功地應(yīng)用于猴體試驗，安全有效，艾滋病和人乳頭狀瘤病毒氣霧疫苗、麻疹氣霧疫苗已經(jīng)世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)進入了臨床試驗。

[1]Corbanie E A,Matthijs M G R,van Eck J H H,et al.Depo?sition of differently sized airborne microspheres in the respira?tory tract of chickens[J].Avian Parhol,2006,35(6):475-485.

[2]Bivas-Benita M,Zwier R,Junginger H E,et al.Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route[J].Euro J Pharm Biopharm,2005,61:214-218.

[3]Corbett M,Bogers W M,Heeney J L,et al.Aerosol immuni?zation with NYVAC and MVA vectored vaccines is safe,sim?ple,and immunogenic[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(6):2046-2051.

[4]Kawakita A,Shirasaki H,Yasutomi M,et al.Immunotherapy with oligomannose-coated liposomes ameliorates allergic symp?toms in a murine food allergy model[J].Allergy,2012,67(3):371-379.

[5]Romero E L,Morilla M J.Topical and mucosal liposomes for vaccine delivery[J].Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobio?technol,2011,3(4):356-375.

[6]Tiwari B,Agarwal A,Kharya A K,et al.Immunoglobulin im?mobilized liposomalconstructs fortransmucosalvaccination through nasal route[J].J Liposome Res,2011,21(3):181-193.

[7]Heurtault B,Frisch B,Pons F.Liposomes as delivery systems for nasal vaccination:strategies and outcomes[J].Expert Opin Drug Deliv,2010,7(7):829-844.

[8]Christensen D,Foged C,Rosenkrands I,et al.CAF01 lipo?somes as a mucosal vaccine adjuvant:In vitro and in vivo in?vestigations[J].Int J Pharm,2010,390(1):19-24.

[9]Ishii M,Kojima N.Mucosal adjuvant activity of oligomannosecoated liposomes for nasal immunization[J].Glycoconj J,2010,27(1):115-123.

[10]Migliore M M,Vyas T K,Campbell R B,et al.Brain deliv?ery of proteins by the intranasal route of administration:a comparison of cationic liposomes versus aqueous solution for?mulations[J].J Pharm Sci,2010,99(4):1745-1761.

[11]Childers N K,Tong G,Michalek S M.Nasal immunization of humanswith dehydrated Liposomescontaining streptococcas mutansantigen[J].OralMicrobiolImmunol,1997,12(6):329-336.

[12]董澤民.賴氨匹林脂質(zhì)體鼻腔給藥的研究[J].中國醫(yī)藥雜志,1995,26(5):199-202.

[13]Sj?lander S,Drane D,Davis R,et al.Intranasal immunisation with influenza-ISCOM induces strong mucosal as well as sys?temic antibody and cytotoxic T-lymphocyte responses[J].Vac?cine,2001,19(28-29):4072-4980.

[14]Morein B,Villacrés-Eriksson M,L?vgren-Bengtsson K.Iscom,a delivery system for parenteral and mucosal vaccination[J].Dev Biol Stand,1998,92:33-39.

[15]Beacock-Sharp H,Donachie A M,Robson N C,et al.A role for dendritic cells in the priming of antigen-specific CD4+and CD8+T lymphocytes by immune-stimulating complexes in vivo[J].Int Immunol,2003,15(6):711-720.

[16]Moore D P,Echaide I,Verna A E,et al.Immune response to Neospora caninum native antigens formulated with immune stimulating complexes in calves[J].Vet Parasitol,2011,175(3-4):245-251.

[17]Heldens J G,Pouwels H G,Derks C G,et al.Duration of immunity induced by an equine influenza and tetanus combi?nation vaccine formulation adjuvanted with ISCOM-Matrix[J].Vaccine,2010,28(43):6989-6996.

[18]Smith R E,Donachie A M,McLaren F H,et al.Preservation of mucosal and systemic adjuvant properties of ISCOM in the absence of functional interleukin-4 or interferon-gamma[J].Im?munology,1998,93(4):556-562.

[19]Kodama S,Hirano T,Noda K,et al.Nasal immunization with plasmid DNA encoding P6 protein and immunostimulatory complexes elicits nontypeable Haemophilus influenzae-specific long-term mucosal immune responses in the nasopharynx[J].Vaccine,2011,29(10):1881-1890.

[20]Hu K F,L?vgren-Bengtsson K,Morein B.Immunostimulating complexes(ISCOM)for nasal vaccination[J].Adv Drug Deliv Rev,2001,51(1-3):149-159.

[21]Heldens J G,Pouwels H G,Derks C G,et al.The first safe inactivated equine influenza vaccine formulation adjuvanted with ISCOM-Matrix that closes the immunity gap[J].Vaccine,2009,27(40):5530-5537.

[22]Pandey R S,Dixit V K.Evaluation of ISCOM vaccines for mucosal immunization against hepatitis B[J].J Drug Target,2010,18(4):282-291.

[23]Huisman W,Schrauwen E J,Pas S D,et al.Evaluation of IS?COM-adjuvanted subunit vaccines containing recombinant fe?line immunodeficiency virus Rev,OrfA and envelope protein in cats[J].Vaccine,2008,26(21):2553-2561.

[24]Smith R E,Donachie A M,Mowat A M.Immune stimulating complexes as mucosal vaccines[J].Immunol Cell Biol,1998,76(3):263-269.

[25]Furrie E,Smith R E,Turner M W,et al.Induction of local innate immune responses and modulation of antigen uptake as mechanisms underlying the mucosal adjuvant properties of immune stimulating complexes(ISCOM)[J].Vaccine,2002,20(17-18):2254-2262.

[26]Fazil M,Md S,Haque S,et al.Development and evaluation of rivastigmine loaded chitosan nanoparticles for brain targeting[J].Eur J Pharm Sci,2012,47(1):6-15.

[27]Verheul R J,Hagenaars N,van Es T,et al.A step-by-step approach to study the influence of N-acetylation on the adju?vanticity of N,N,N-trimethyl chitosan(TMC)in an intranasal nanoparticulate influenza virus vaccine[J].Eur J Pharm Sci,2012,45(4):467-474.

[28]Hashem F M,Fahmy S A,El-Sayed A M,et al.Develop?mentand evaluation ofchitosan microspheresfortetanus,diphtheria and divalent vaccines:a comparative study of sub?cutaneous and intranasaladministration in mice[J].Pharm Dev Technol,2013,18(5):1175-1185.

[29]Svindland S C,Jul-Larsen ?,Pathirana R,et al.The muco?sal and systemic immune responses elicited by a chitosan-ad?juvanted intranasal influenza H5N1 vaccine[J].Influenza Oth?er Respi Viruses,2012,6(2):90-100.

[30]Patil S B,Sawant K K.Chitosan microspheres as a delivery system for nasal insufflation[J].Colloids Surf B Biointerfaces.2011,84(2):384-389.

[31]Moon H J,Lee J S,Talactac M R,et al.Mucosal immuniza?tion with recombinantinfluenza hemagglutinin protein and poly gamma-glutamate/chitosan nanoparticles induces protec?tion against highly pathogenic influenza A virus[J].Vet Micro?biol,2012,160(3-4):277-289.

[32]Nazar H,Fatouros D G,van der Merwe S M,et al.Thermo?sensitive hydrogelsfornasaldrug delivery:the formulation and characterisation of systems based on N-trimethyl chitosan chloride[J].Eur J Pharm Biopharm,2011,77(2):225-232.

[33]Slütter B,Bal S,Keijzer C,et al.Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles:nanoparti?cle characteristics determine quality and strength of the anti?bodyresponse in mice againstthe encapsulated antigen[J].Vaccine,2010,28(38):6282-6291.

[34]Jintapattanakit A,Peungvicha P,Sailasuta A,et al.Nasal ab?sorption and local tissue reaction of insulin nanocomplexes of trimethyl chitosan derivatives in rats[J].J Pharm Pharmacol,2010,62(5):583-591.

[34]du Plessis L H,Lubbe J,Strauss T,et al.Enhancement of nasal and intestinal calcitonin delivery by the novel pheroid fatty acid based delivery system,and by N-trimethyl chitosan chloride[J].Int J Pharm,2010,385(1-2):181-186.

[35]Wang X,Zheng C,Wu Z,et al.Chitosan-NAC nanoparticles as a vehicle for nasal absorption enhancement of insulin[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2009,88(1):150-161.