■叢立新 張金玉 趙志輝

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,吉林省吉林市 132101；2.吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春 130062）

MicroRNA(miRNA)是一類長度約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼的小RNA分子，廣泛存在于各種生物體內(nèi)。miRNA通過作用于靶mRNA的3′UTR區(qū)，引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，從而實(shí)現(xiàn)對靶基因表達(dá)水平的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在細(xì)胞發(fā)育分化、組織器官形成、病毒感染以及腫瘤的發(fā)生等多種生物學(xué)過程中均發(fā)揮重要作用。miRNA幾乎可以參與生物體的各種生命活動(dòng)，包括生長發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生和凋亡、病毒的復(fù)制以及各種生理和疾病過程。自1993年人們在線蟲中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)miRNA（lin-4）之后，又發(fā)現(xiàn)let-7，使得人們越來越意識(shí)到miRNA在生物體中的重要性。miRNA2002年被美國著名雜志Science評選為年度十大科技突破的第一條，miRNA的發(fā)展及研究前景逐漸為其所取得的顯著進(jìn)展所證實(shí)。鑒于miRNA存在的普遍性及其調(diào)控功能的多樣性，對miRNA的發(fā)現(xiàn)及功能的研究成為世界各國科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)和生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)及前沿。

1 miRNA的鑒定方法

1.1 實(shí)驗(yàn)法

小RNA分子的直接克隆測序仍然是目前鑒定miRNA的主要方法。第一種方法是將組織RNA經(jīng)變形聚丙烯凝膠電泳分離，回收19～25 nt的小分子RNA，將這些小分子RNA的3′和5′連上接頭，逆轉(zhuǎn)錄后用與接頭對應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將這些片段進(jìn)行克隆，構(gòu)建cDNA文庫，并對每個(gè)克隆進(jìn)行測序分析。另一種方法為利用15%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離總RNA中16～28 nt的小片段，poly（A）聚合酶的作用在這些小片段的3′端進(jìn)行多聚腺苷酸化反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并在cDNA的3′端進(jìn)行多聚鳥苷酸化反應(yīng)，后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆測序分析。

通過實(shí)驗(yàn)法直接進(jìn)行miRNA的克隆，最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠精確地確認(rèn)每一個(gè)miRNA，并準(zhǔn)確區(qū)分開只差一個(gè)堿基的家族分子。但是，這種方法也存在著明顯的局限性：第一，文庫構(gòu)建時(shí)間較長，并且每個(gè)文庫都需要經(jīng)過大量的測序反應(yīng)才能獲得足夠的數(shù)據(jù)，耗時(shí)、低效且價(jià)格昂貴；第二，有些miRNA具有組織特異性或在所研究的組織中可能低豐度表達(dá)，另外一些其它內(nèi)源性非編碼RNA和mRNA的降解產(chǎn)物產(chǎn)生的干擾，使該方法很難鑒定組織特異性或低表達(dá)的或具有特殊的堿基構(gòu)成，存在轉(zhuǎn)錄后修飾的miRNA(王玫等，2007）。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，大規(guī)模的測序技術(shù)不斷涌現(xiàn)。利用高效測序技術(shù)，一個(gè)標(biāo)簽序列可以一次測出一段序列中的17個(gè)核苷酸序列。近年來高通量測序技術(shù)（如454，Solid和Solexa等測序平臺(tái)）的出現(xiàn)使該方法得到了極大的完善，能夠一次性獲得百萬級的高質(zhì)量小RNA分子，并從全基因組范圍內(nèi)發(fā)掘已知和未知，保守和非保守的miRNA，大大的彌補(bǔ)了過去難于鑒定低豐度的miRNA缺點(diǎn)。以深度測序?yàn)榛A(chǔ)的測序分析技術(shù)剛剛興起，并且每次測序可獲得3Gbp的序列需要，因此需要借助生物信息學(xué)的技術(shù)來處理分析。

1.2 生物信息學(xué)分析法

隨著全基因組測序工作的完成，生物信息學(xué)方法逐漸發(fā)展成為鑒定miRNA的有力方法，同時(shí)，該方法彌補(bǔ)了直接克隆法的一些不足，大大提高了鑒定miRNA的效率。目前，科研工作者根據(jù)已知miRNA的特征信息及其對靶分子的作用方式建立了多種miRNA的計(jì)算機(jī)識(shí)別方法。第一個(gè)預(yù)測軟件是MiRscan，它能特異性的識(shí)別2個(gè)物種間的同源序列。該軟件是由Lim等[2]依據(jù)與已知miRNA相似性開發(fā)設(shè)計(jì)的。并且在線蟲和人類中利用該軟件共預(yù)測到了35和107個(gè)新miRNA。

利用已知miRNA的序列和結(jié)構(gòu)的保守性在全基因組范圍內(nèi)搜索miRNA是分子生物學(xué)最常用的搜索方法，即通過對miRNA及其成熟序列的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的保守性分析尋找新的候選分子。典型的根據(jù)同源性搜索而設(shè)計(jì)的軟件srnaloop是由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Grad等利用miRNA的序列保守性及結(jié)構(gòu)相似性設(shè)計(jì)而成的。該軟件是一個(gè)類似于BLAST的應(yīng)用程序，但是該軟件支持更短片段并排列成互補(bǔ)的堿基對。該軟件已在線蟲中預(yù)測出214種新的miRNA。另外，越來越多的研究者利用軟件分析發(fā)現(xiàn)了新的miRNA，如Wang等開發(fā)的計(jì)算機(jī)方法MiRAlign是一種依靠序列和結(jié)構(gòu)比對來尋找動(dòng)物中的miRNA的方法。

當(dāng)利用同源性沒有發(fā)現(xiàn)新的miRNA時(shí)，就需要科研人員尋找其他的方法，如利用靶序列的保守性識(shí)別miRNA。在生物體內(nèi)，同一miRNA可能調(diào)控多個(gè)靶分子；多個(gè)miRNA也可能作用于同一個(gè)mRNA靶分子。目前，一些研究者利用靶序列中潛在的保守性作為識(shí)別miRNA的重要依據(jù)(Park W，2002)。在成熟miRNA中的種子序列（2～8位置的7個(gè)核苷酸），他們在與靶mRNA結(jié)合中起著重要的作用(Lewis BP，2003)。Xie等(2005)在 mRNA 的 3′非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)了106個(gè)保守的基本序列，其中72個(gè)與大約一半的已知miRNA5′端相結(jié)合組成6～8 bp的種子雙螺旋。find-MicroRNA軟件是Adai等(2005)在擬南芥中利用單基因組方法設(shè)計(jì)的搜索miRNA的軟件,該軟件主要用于植物miRNA的鑒定。它主要依賴miRNA與其對應(yīng)的靶序列緊密互補(bǔ)來識(shí)別候選miRNA。之后該軟件將進(jìn)一步對這些候選miRNA的成熟序列的相鄰序列的互補(bǔ)性進(jìn)行分析,使得一個(gè)RNA內(nèi)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的組成和已知miRNA前體結(jié)構(gòu)保持一致。擬南芥基因組中有29 399個(gè)轉(zhuǎn)錄本可以和27 987個(gè)特定基因座相對應(yīng),用此軟件對其分析可以在基因間隔區(qū)內(nèi)識(shí)別潛在的microRNA前體序列。

實(shí)驗(yàn)方法和生物信息學(xué)方法由于各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此，單一的方法可能不能滿足試驗(yàn)的需要，或鑒定不出某些特異性的miRNA序列，因此，需要科研工作者同時(shí)結(jié)合這兩個(gè)方法，這樣在能在各種物種中準(zhǔn)確的找到盡可能多的新的miRNA。

2 miRNA的檢測方法

2.1 miRNA芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是近年來興起的一種高通量、靈敏度較高的檢測基因表達(dá)的方法。該方法能夠在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測到所有已知miRNA的表達(dá)譜。miRNA表達(dá)譜的精確分析是研究miRNA在生物體中的功能及其所發(fā)揮的作用的基礎(chǔ)。目前，有關(guān)該技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種生物體的miRNA的表達(dá)譜分析，主要包括各種組織miRNA表達(dá)譜以及在各種生理和病理狀態(tài)下的miRNA表達(dá)譜。miRNA芯片的制作中關(guān)鍵的步驟就是探針的設(shè)計(jì)，一般表達(dá)譜芯片采用合成的寡核苷酸或cDNA片段作為捕獲探針，對轉(zhuǎn)錄本的高特異性和高親和度是理想探針的目標(biāo)。由于miRNA的雜交溫度和成熟序列長度的限制，使得對探針的設(shè)計(jì)也受到了一定程度的限制。當(dāng)利用特定的溫度標(biāo)記芯片的miRNA探針時(shí)，高Tm值的探針和低Tm值的探針將可能產(chǎn)生不平行或非特異性的信號。理論上基因芯片并不能進(jìn)行定量的測量，由于不同的miRNA具有不同的親和力，但是基因芯片可以用于不同狀態(tài)下miRNA表達(dá)量的比較分析。因此，通?？蒲腥藛T會(huì)利用增加或減少探針的堿基長度來平衡探針的雜交溫度，已獲得更精確的芯片分析結(jié)果。

Liu等用含有245個(gè)人類及模式動(dòng)物鼠的基因組探針的微芯片篩選miRNA，Chen Jian-Fu等通過基因芯片的方法證實(shí)了miR-1與miR-133在肌肉的發(fā)育過程中能夠起到調(diào)節(jié)作用。但是，基因芯片的方法也存在著一定的不足之處，主要包括制作和檢測均需要昂貴的儀器設(shè)備，而且結(jié)果的重復(fù)性比較差；對于不同的miRNA需要優(yōu)化不同的雜交條件，因此對于高度相似的miRNA或同一家族中的miRNA很難區(qū)分。

最新研究結(jié)果顯示，一種新的液相芯片將為后基因組時(shí)代的科學(xué)發(fā)展提供一種新的強(qiáng)有力的技術(shù)支持。該芯片的體系是由許多不同的小球體為主要基質(zhì)所構(gòu)成的，其中每個(gè)小球體上固定不同的探針分子，在每一個(gè)特定的探針上都具有一個(gè)獨(dú)特的色彩編號以區(qū)分不同的探針，將這些小球體懸浮于一個(gè)液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該方法能夠?qū)ν粋€(gè)樣品的不同分子進(jìn)行快速定性，定量分析，因此這種方法也成為xMAP技術(shù)。這種精確的能夠同時(shí)定性，定量的分析方法，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

2.2 RNA印跡檢測方法

該方法也叫做Northern blot，廣泛應(yīng)用于檢測分析miRNA的表達(dá)。RNA印跡通過凝膠電泳的方法將不同大小和不同分子量的總RNA進(jìn)行分離，并將分離得到的RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素膜上與已知標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交。所得結(jié)果可同時(shí)用于miRNA的表達(dá)水平的定量檢測，和用于區(qū)分miRNA前體與成熟體的位置。因此，該方法被譽(yù)之miRNA檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

目前，地高辛（DIG）標(biāo)記和生物素（BIOTIN）標(biāo)記等一些無放射性的探針標(biāo)記方法已被廣泛應(yīng)用。但是該方法靈敏度和特異性不高，鑒于此，科研工作者發(fā)展了用鎖核酸（LNA）修飾的雜交探針取代傳統(tǒng)的方法。滲入LNA可使探針在短時(shí)間內(nèi)獲得較高的Tm值，同時(shí)滲入LNA的探針與核酸序列雜交具有嚴(yán)格的序列特異性，在每3個(gè)堿基中滲入1個(gè)LNA，可以達(dá)到最好的雜交效果，研究表明，LNA修飾的寡核苷酸探針能夠使檢測的靈敏度較傳統(tǒng)方法提高100倍以上。

2.3 原位雜交檢測方法

即miRNA ISH，通過將組織或細(xì)胞中的核酸與標(biāo)記的DNA或RNA核酸探針進(jìn)行雜交，檢測互補(bǔ)DNA或RNA在組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞中位置，這種技術(shù)，就叫做原位雜交。特異性的原位雜交可以檢測細(xì)胞，胚胎以及在福爾馬林固定或石蠟包埋組織中miRNA的表達(dá)，該方法能更直觀的展現(xiàn)miRNA的空間表達(dá)模式。該方法可以用來檢測細(xì)胞水平的miRNA，還可以檢測和比較不同細(xì)胞系中的miRNA的表達(dá)。但是其主要缺點(diǎn)是技術(shù)掌握困難，所用試劑價(jià)格昂貴，試驗(yàn)周期長。

LNA也同樣是原位雜交技術(shù)中最常用的探針。Wienholds等首次應(yīng)用LNA探針在斑馬魚中檢測了數(shù)百個(gè)miRNA的空間表達(dá)模式。隨著科技的發(fā)展，原位雜交的技術(shù)也得到了改進(jìn)，Robert等[15]采用RNA探針，利用TMAC的高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌及RNaseA處理產(chǎn)生序列特異性的雜交條件來檢測成熟的miRNA。應(yīng)用LNA修飾的miRNA寡聚核苷酸探針的原位雜交目前已經(jīng)成功用于斑馬魚、小鼠、雞等物種的胚胎或組織切片研究。

2.4 熒光定量PCR檢測方法

成熟的miRNA分子片段較短，常規(guī)的RT-PCR無法完成miRNA的定量或半定量檢測。莖環(huán)狀引物以及RNA加尾和引物延伸RT-PCR方法的發(fā)明，較好的解決了這一問題。實(shí)時(shí)定量PCR的最大優(yōu)點(diǎn)是其檢測具有較高的精度及靈敏度，不需要標(biāo)記，操作簡單等。利用莖環(huán)狀引物所涉及的熒光定量PCR引物，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得多個(gè)結(jié)果，檢測多個(gè)miRNA的表達(dá)并且需要的RNA量也相對較少，因此被廣泛用于組織miRNA表達(dá)譜的構(gòu)建。

Stem-loop實(shí)時(shí)定量PCR是miRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析的主要檢測方法。該方法具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：特異性高，特異的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物能夠保證定量反應(yīng)不受前體的干擾，并可精確辨識(shí)高度同源的miRNA序列；所需樣品較少，需要的總RNA量僅1～10 ng左右；定量線性范圍較寬和檢測靈敏度較高，從幾個(gè)拷貝到幾萬個(gè)拷貝，定量線性范圍可以跨越7個(gè)數(shù)量級；適用范圍廣，純化的RNA、總RNA以及細(xì)胞裂解物均可以用于檢測miRNA的表達(dá)量，同時(shí)，還可以進(jìn)行單細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜分析。Varkonyi-Gasic等利用該技術(shù)成功地對擬南芥中多種miRNA進(jìn)行了差異表達(dá)分析。

（參考文獻(xiàn)16篇，刊略，需者可函索）