■歐陽萬金 龍民慧 侯永清 肖 航 丁斌鷹 易 丹 王 蕾

（動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室武漢輕工大學(xué)，湖北武漢 430023）

L-谷氨酰胺（L-glutamine，GLN）是母體乳汁中一種含量非常豐富的游離氨基酸，也是條件性必需氨基酸。GLN不僅作為腸上皮細(xì)胞的主要能量物質(zhì)，為小腸上皮細(xì)胞的分化和增殖提供能量，而且還可通過調(diào)節(jié)谷氨酰胺酶活性、相關(guān)細(xì)胞信號通路和蛋白合成等促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖。研究表明，GLN可促進(jìn)細(xì)胞增殖和腸道發(fā)育，緩解各種因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

Nα-乙酰-L-谷氨酰胺（Nα-acetyl-L-glutamine，NAG）是GLN乙?；难苌?，其生理功能與谷氨酰胺相似，但在水溶液中比谷氨酰胺穩(wěn)定。NAG可治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍等疾病，在治療腦功能障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾患方面都有很好效果。近年研究發(fā)現(xiàn)，NAG能促進(jìn)氨基酸轉(zhuǎn)運，加強(qiáng)細(xì)胞谷胱甘肽和DNA合成，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，可作為高強(qiáng)度訓(xùn)練恢復(fù)過程中的營養(yǎng)支持物。

L-精氨酸（L-arginine，ARG）是胎兒和新生兒的必需氨基酸，成年動物的條件性必需氨基酸，也是組織蛋白最豐富的氮源及細(xì)胞合成肌酸、脯氨酸、谷氨酸、多胺和一氧化氮等的前體。有研究發(fā)現(xiàn)，ARG可改善動物繁殖性能、心血管功能、神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道發(fā)育，調(diào)控免疫能力；體外研究發(fā)現(xiàn)，ARG還可促進(jìn)哺乳動物細(xì)胞增殖和癌細(xì)胞凋亡，這為ARG的以上功能提供了理論依據(jù)。

L-瓜氨酸（L-citrulline，CIT）是一種非蛋白質(zhì)α-氨基酸，具有肽鍵形成能力，但不參與蛋白質(zhì)的合成。它是人體尿素循環(huán)中間產(chǎn)物，與人體氨氮排泄有非常重要關(guān)系。有研究表明，CIT具有提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)血液循環(huán)，診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，作為異體排斥效應(yīng)的指示劑、反映腸道衰竭程度，增強(qiáng)男性和雄性動物性功能，抗氧化，維持肌肉功能等生理功能。

α-酮戊二酸（Alpha-ketoglutaric acid，AKG）是三羧酸循環(huán)重要中間產(chǎn)物，也是動物機(jī)體谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸等的合成前體物。研究表明，AKG可改善能量狀態(tài)、增強(qiáng)腸道功能，緩解急性肺損傷，維持氧化還原平衡和提高動脈彈性；AKG在體外可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白合成，抑制癌細(xì)胞凋亡。

L-脯氨酸（L-Proline，PRO）是明膠、麩蛋白、玉米醇溶蛋白、鯡精蛋白、酪蛋白等多種蛋白的組成成分，特別是明膠中最多（約占20%）。PRO是合成人體蛋白質(zhì)重要氨基酸之一，是氨基酸輸液的重要原料，也是合成卡托普利、依那普利等一線降壓藥物的主要中間體，已被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。在食品上的用途，PRO主要做營養(yǎng)增補(bǔ)劑和風(fēng)味劑，與糖共熱發(fā)生氨基酸-羰基反應(yīng)生成特殊的香味物質(zhì)。PRO是膠原蛋白的重要組成部分，對膠原合成、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生及免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)的傷口愈合和恢復(fù)至關(guān)重要。PRO在孕體代謝、生長和發(fā)育中有重要作用，對治療子宮生長受限有潛在價值。葛奎等發(fā)現(xiàn)，PRO等活性分子在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

ARG、NAA、CIT、PRO、AKG、GLN和NAG都是具有重要生理功能的物質(zhì)，相互之間也存在密切關(guān)系。NAA可以在體內(nèi)通過脫乙酰基作用生成ARG，發(fā)揮ARG的的功能；CIT在腎臟中可以合成ARG，而在小腸中ARG在鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的作用下可以生成CIT；豬小腸能吸收GLN并釋放CIT和ARG，泌乳母豬吸收大量的ARG和支鏈氨基酸，代謝形成脯氨酸和GLN；NAG通過脫乙?；饔蒙蒅LN；PRO是合成鳥氨酸的原料，通過脯氨酸氧化酶作用生成吡咯啉-5-羧酸，并進(jìn)一步通過鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶形成CIT；AKG具有谷氨酰胺碳架，通過谷氨酰胺脫氫酶或轉(zhuǎn)氨酶作用生成谷氨酸，并進(jìn)一步通過谷氨酰胺合成酶形成GLN。

本試驗通過研究GLN、NAG、PRO、ARG、NAA、CIT和AKG對豬小腸上皮細(xì)胞活力與生長的影響，探明這幾種氨基酸及其衍生物對腸道細(xì)胞生長的作用效果，篩選出可有效促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞生長的氨基酸或其衍生物，為進(jìn)一步研究這幾種功能性氨基酸對腸道功能的影響提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

豬小腸上皮細(xì)胞-1（IPEC-1,Texas A&M University），L-谷氨酰胺（Amresco公司），Nα-乙酰-L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、N-α-乙酰-L-精氨酸、L-瓜氨酸、α-酮戊二酸均為Sigma公司試劑，胎牛血清（FBS）和雙抗（PSF）為Gibco公司試劑，DMEM-F12（Hyclone公司）、定制DMEM培養(yǎng)基為市售產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組

試驗分兩次進(jìn)行，試驗處理及分組情況見表1～表3。

表1 試驗一處理與分組

表2 試驗二處理與分組

表3 試驗三分組

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

IPEC-1用含5%FBS和1%PSF的DMEM-F12培養(yǎng)基（包含17.5 mM D-葡萄糖，2.5 mM L-谷氨酰胺，0.7 mM L-精氨酸，15 mM HEPES（pH=7.4），5 μg/ml胰島素，5 μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5 ng/ml硒，5 μg/l EGF），于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，實驗時選用對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液，計數(shù)調(diào)整濃度。

1.2.3 CCK8法測定不同氨基酸及其衍生物對細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞以約5×104個/ml接種于96孔板（Corning公司，USA）中，每孔接種0.1 ml。置于37 ℃，5%CO2的孵箱培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后，棄去孔中培養(yǎng)液，加入0.1 ml相應(yīng)的特制DMEM培養(yǎng)基，以測定氨基酸及其衍生物對IPEC-1細(xì)胞活力的影響。細(xì)胞每天換液，分別在試驗的第1、2、3、4 d測定OD值。測定方法：仔細(xì)吸出孔中原有培養(yǎng)液，每孔加入110 μl混合液（10 μl CCK8 試劑與 100 μl各組相應(yīng)的特制培養(yǎng)基），繼續(xù)在孵箱中孵育一定時間，用酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）在450 nm波長（參考波長為650 nm）下測定其吸光度（optical density，OD）。

1.2.4 不同氨基酸及其衍生物對細(xì)胞生長的影響

細(xì)胞以約4×104個/ml接種在24孔板（Corning公司，USA）中，每孔接種2 ml。置于37 ℃，5%CO2的孵箱培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后，仔細(xì)棄去孔中培養(yǎng)液，加入2 ml相應(yīng)的定制DMEM培養(yǎng)基，以測定不同氨基酸及其衍生物對IPEC-1細(xì)胞生長的影響。細(xì)胞每天換液，分別在試驗的第1、2、3、4 d用自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)（Bio-Rad公司，Singapore）并計算各孔細(xì)胞數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

全部數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏多重比較，所得數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAG和GLN對IPEC-1細(xì)胞生長的影響(見表5)

由表5可知，在試驗的1至4 d，GLN組細(xì)胞數(shù)量均顯著多于對照組（P＜0.05）；在前3 d，NAG組細(xì)胞數(shù)量與對照組比差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于GLN組（P＜0.05）。第4 d，NAG組細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.05），但與GLN組差異不顯著（P＞0.05）。

表4 定制DMEM培養(yǎng)基組分

表5 NAG和GLN對IPEC-1細(xì)胞生長的影響

2.2 ARG、NAA、CIT和AKG對IPEC-1細(xì)胞生長的影響

2.2.1 對IPEC-1細(xì)胞OD值的影響(見表6)

由表6可知，在試驗的第1～4 d，GLN組細(xì)胞OD值顯著高于對照組和其它試驗組（P＜0.05）；NAA組細(xì)胞OD值顯著低于對照組（P＜0.05）。前2 d，ARG組、CIT組和AKG組細(xì)胞OD值均顯著低于對照組（P＜0.05）。

表6 ARG等對IPEC-1細(xì)胞OD值的影響

2.2.2 對IPEC-1細(xì)胞數(shù)量的影響(見表7)

表7 ARG等對IPEC-1細(xì)胞數(shù)量的影響

由表7可知，在試驗的第1～4 d，GLN組細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組和各處理組（P＜0.05）；在第2 d，AKG組細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組、CIT組和NAA組（P＜0.05）。在第4 d，AKG組細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.05）；CIT組極顯著高于對照組（P＜0.01）；ARG組和NAA組顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.3 PRO對IPEC-1細(xì)胞生長的影響(見表8)

由表8可知，在試驗第1～4 d，兩個試驗組細(xì)胞數(shù)量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），兩試驗組之間差異也不顯著（P＞0.05）。

表8 PRO對IPEC-1細(xì)胞生長的影響

3 討論

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)代謝、消化和吸收的主要器官。腸道也是機(jī)體與外界環(huán)境接觸表面積最大的器官，也是體內(nèi)最大的免疫器官。促進(jìn)仔豬小腸上皮細(xì)胞增殖，對促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育、對維持仔豬健康、促進(jìn)仔豬生長具有重要意義。

3.1 GLN和NAG對IPEC-1細(xì)胞活力與生長的影響

GLN是快速生長和分化細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞等的重要能量底物，也是蛋白質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子。GLN是腸上皮細(xì)胞增殖必需的氨基酸，其缺乏會誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡。

GLN能促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2和HT-29、鼠空腸上皮細(xì)胞（IEC-6）以及鯉魚IEC的增殖。本試驗一和試驗二結(jié)果顯示，GLN組細(xì)胞數(shù)量和OD值顯著高于對照組，說明0.5 mM GLN能提高IPEC-1的細(xì)胞活性，促進(jìn)其生長，這與聶新志等人的研究結(jié)果一致。同時，本試驗一結(jié)果又顯示，第4 d NAG組細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組，可知NAG可促進(jìn)第4 d IPEC-1細(xì)胞的生長。

3.2 AKG對IPEC-1細(xì)胞活力與生長的影響

動物在生命活動中，必須從外界環(huán)境攝取營養(yǎng)物質(zhì)，作為機(jī)體活動和組織生長的物質(zhì)和能量來源。氨基酸是小腸的主要能源物質(zhì)，小腸黏膜上皮細(xì)胞的自我更新、高度有序結(jié)構(gòu)的維持和各種生理功能的進(jìn)行都需要能量，GLN和谷氨酸可作為小腸的主要能量物質(zhì)，為諸如營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移和高效率的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等腸道ATP依賴性的代謝過程提供能量。AKG是小腸腸道重要代謝燃料之一，可以節(jié)省谷氨酸和GLN的消耗，約80%AKG的氧化是在腸道中完成。

本實驗室的前期結(jié)果表明，AKG可在一定程度上提高斷奶仔豬的生長性能，改善小腸組織學(xué)形態(tài)和吸收功能，提高抗氧化能力；日糧添加1%AKG可有效緩解LPS慢性應(yīng)激導(dǎo)致的仔豬小腸黏膜損傷。

研究表明，AKG為GLN的最佳替代物。本試驗結(jié)果表明，AKG組細(xì)胞數(shù)量和OD值均顯著低于GLN組，表明體外條件下AKG不能完全替代GLN。這與動物試驗的結(jié)果并不一致，可能是體外條件下腸上皮細(xì)胞對AKG的吸收利用率有關(guān)。

3.3 ARG和NAA對IPEC-1細(xì)胞活力與生長的影響

動物機(jī)體中幾乎所有組織均利用ARG合成胞漿蛋白和核蛋白，ARG在促進(jìn)肌肉內(nèi)蛋白質(zhì)合成、增加機(jī)體氮儲留、增強(qiáng)機(jī)體的免疫力、細(xì)胞分裂、傷口復(fù)原和激素分泌等各種生理過程中，都有著重要的作用。ARG是內(nèi)生性一氧化氮(NO)的唯一前體。ARG是動物體蛋白質(zhì)合成所必需的氨基酸，在應(yīng)激狀態(tài)下和特殊生長階段，ARG為必需氨基酸，體內(nèi)合成的ARG不能滿足動物生理代謝需要。研究表明，ARG的不足是斷奶仔豬無法達(dá)到最大生長速度的重要因素。

Tan等研究結(jié)果表明，上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中較適宜上皮細(xì)胞的增殖及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的精氨酸濃度為0.3 mM，低于0.15 mM時對細(xì)胞增殖無影響。本試驗二結(jié)果顯示，添加0.25 mM ARG組細(xì)胞數(shù)量與對照組差異不顯著，提示在非應(yīng)激狀態(tài)下，0.1 mM ARG可能已滿足IPEC-1細(xì)胞生長的需要；ARG組和NAA組細(xì)胞數(shù)量和OD值顯著或極顯著低于GLN組，說明在無GLN的條件下，ARG和NAA并不能促進(jìn)IPEC-1細(xì)胞的生長；第4 d NAA組細(xì)胞數(shù)量高于對照組，提示NAA可促進(jìn)第4 d IPEC-1細(xì)胞的生長。

3.4 CIT對IPEC-1細(xì)胞活力與生長的影響

CIT是一種非必需氨基酸，它是在動物體內(nèi)鳥氨酸循環(huán)中產(chǎn)生的，不是體內(nèi)任何重要蛋白質(zhì)和酶的組成，一般只產(chǎn)生在鳥氨酸轉(zhuǎn)化為尿素的循環(huán)過程中，但CIT對體內(nèi)氮的平衡和新陳代謝方面起著很重要的作用。CIT被吸收后在腎臟、大腦、肌肉和一些其他組織中轉(zhuǎn)化為ARG和NO。ARG及NO均可促進(jìn)仔豬的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，CIT可提高仔豬生長性能，促進(jìn)動物生長。本試驗二結(jié)果顯示，第4 d，CIT組細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組，說明CIT可促進(jìn)第4 d IPEC細(xì)胞的生長。

3.5 PRO對IPEC-1細(xì)胞生長的影響

PRO是新生仔豬腸細(xì)胞生成CIT和ARG的主要前體物，具有防止淋巴細(xì)胞凋亡、刺激細(xì)胞生長、促進(jìn)抗體產(chǎn)生等作用。研究表明，在仔豬早期快速生長時期，PRO可能是必需氨基酸，內(nèi)源合成的PRO在為新生仔豬和斷奶仔豬提供精氨酸方面起到重要作用。Brunton等發(fā)現(xiàn)，ARG和PRO是小豬腸道不可缺少的氨基酸。本實驗室前期動物試驗表明，日糧添加PRO可在一定程度緩解LPS多次刺激導(dǎo)致的仔豬生長抑制和腸道損傷，可能是通過細(xì)胞因子以及抗氧化能力的提高緩解LPS刺激對仔豬造成的應(yīng)激。本次試驗結(jié)果顯示，0.2 mM PRO組和0.4 mM PRO組細(xì)胞數(shù)量與對照組相比無明顯差異，這可能說明在正常生理狀態(tài)下，PRO對腸道功能無影響，而在應(yīng)激條件下，脯氨酸對腸道功能有保護(hù)作用。

4 結(jié)論

① NAG、AKG、CIT、NAA 和ARG均能提高第4 d IPEC-1細(xì)胞的數(shù)量；

②在這幾種氨基酸及其衍生物中，GLN促進(jìn)IPEC-1細(xì)胞生長的作用效果最好，而PRO無效果。

（參考文獻(xiàn)60篇，刊略，需者可函索）