孫長青，賀 瑋，李偉光，李志慧，張成崗

(1天津醫(yī)科大學寶坻臨床學院天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院，天津301800;2軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室，全軍軍事認知與心理衛(wèi)生研究中心)

據(jù)統(tǒng)計，80%的卒中是由于大腦中動脈供血區(qū)域的缺血性破壞導致［1～3］。腦缺血損傷動物模型是研究腦血管疾病損傷機制和防治措施不可缺少的工具［4，5］。大腦中動脈栓塞(MCAO)［6］是卒中研究領域常見的模型制備方法［7］，目前最常用的是線栓法［8，9］。線栓法制備的卒中動物模型神經(jīng)病理和認知障礙損傷程度均相對較輕，適合作為腦血管疾病動物模型。2012年9月～2013年6月，我們使用體視顯微鏡、顯微鑷子和留置針對傳統(tǒng)線栓法進行改良，觀察改良線栓法制備腦缺血損傷動物模型的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。模型制作前12 h禁食不禁水，隨機分為改良組(改良線栓法)和傳統(tǒng)組(傳統(tǒng)線栓法)，每組30只。

1.2 材料 器械:麻醉機(美國Midmark公司);體視顯微鏡(天津醫(yī)用光學儀器廠);顯微外科手術器械(上海醫(yī)療器械有限公司手術器械廠);自制金屬拉鉤;一次性使用靜脈留置針(威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司);麻醉劑異氟烷(上海雅培制藥有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)線栓法［10］10%水合氯醛腹腔注射麻醉傳統(tǒng)組大鼠后，頸部手術區(qū)備皮、消毒，頸部正中切口;右側(cè)頸動脈鞘處分離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎翼腭突動脈、頸外動脈及頸總動脈。在頸總動脈結(jié)扎處遠心端剪一斜切口，插入栓線;進線17～21 mm時，感到明顯阻力，證明栓線頭端已達大腦中動脈起始處;在頸總動脈插口結(jié)扎固定栓線，逐層縫合。

1.3.2 改良線栓法 改良組大鼠麻醉(麻醉機)后，平臥固定于手術臺，頸部用碘伏原液進行消毒，旁正中切開，切口長2～4cm;分離肌肉后可見到頸動脈，通過自制拉鉤牽拉皮膚和肌肉以完整暴露手術視野;體視顯微鏡下操作，輕柔分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，勿傷及迷走神經(jīng);結(jié)扎頸外動脈，并在頸總動脈近心端結(jié)扎頸總動脈，同時在頸總動脈下備線，然后用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈;顯微鑷子末端置于頸總動脈結(jié)扎和備線部位之間的下方，使用一次性靜脈留置針將顯微鑷子兩末端上的頸總動脈刺破一孔，可見血液流入留置針內(nèi);顯微鑷子不動，撤掉留置針，將大鼠用線栓沿刺破的頸總動脈孔插入頸總動脈，并用彎頭眼科鑷將尼龍線栓經(jīng)頸內(nèi)動脈進入顱內(nèi)推送至大腦中動脈開口處，以阻斷大腦中動脈血流;尼龍線栓插入深度為從頸總動脈分叉部起18～20 mm，并用頸總動脈下的備線結(jié)扎，以防線栓拔出，然后剪掉多余線栓并縫合切口。術后大鼠置于安靜溫暖處飼養(yǎng)。參照Zea Longa評定進行神經(jīng)功能缺損程度的評價:0級為無缺陷;1級為不能伸展對側(cè)前肢;2級為對側(cè)前肢屈曲;3級為輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;4級為嚴重的轉(zhuǎn)圈;5級為對側(cè)癱瘓。3～4級為模型制作成功。

1.3.3 觀察指標 比較兩組造模成功率、手術時間、術中出血量及神經(jīng)損傷情況。

1.3.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

改良組失敗1只、死亡2只、成功27只，成功率90.00%(27/30);傳統(tǒng)組失敗4只、死亡6只、成功20只，成功率66.67%(20/30);兩組成功率比較，P＜0.05。改良組神經(jīng)損傷1只(3.70%)，傳統(tǒng)組5只(25.00%)，P ＞ 0.05。改良組手術時間(24.04±2.87)min，傳統(tǒng)組(49.95±5.79)min，P ＜0.01。改良組術中出血量(1.79±0.72)mL，傳統(tǒng)組(3.53±1.07)mL，P ＜0.01。

3 討論

線栓法制備的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型［9］，是模擬缺血性卒中患者最常見的動物模型，具有創(chuàng)傷性小、缺血效果肯定、重復性好、無需開顱、可準確控制缺血及再灌注時間、大腦中動脈閉塞及再灌注效果好等優(yōu)點［11，12］。傳統(tǒng)線栓法制備MCAO模型是提拉頸總動脈下的備線用剪刀剪破［13，14］，或者用注射器針頭刺破頸總動脈和進行線栓插入，手術操作在肉眼下進行。使用剪刀剪破血管時，在動脈上剪口不易控制口徑大小;口徑邊緣銳利，提拉時容易斷開;很容易剪斷血管;即使剪得很好，但由于血液流出而導致血管塌陷，在插入線栓時還需要花費一定時間才能找到管腔;導致MCAO模型不易成功。而采用注射器針頭刺破血管的方法很容易把整個血管都穿透，甚至穿斷。使用留置針代替注射器針頭進行操作時，由于留置針的末端比針頭斜面短很多，但銳利程度相同，很容易進入血管腔而不穿透血管，而且留置針末端進入血管后很快看見血液流出，此時血管的破孔直徑可以讓線栓順利進入，同時也能夠防止留置針繼續(xù)向血管腔內(nèi)進入。初做MCAO模型的人對于頸內(nèi)外動脈的區(qū)分往往有一定困難，通?？筛鶕?jù)血管的命名來判斷，即頸內(nèi)動脈在后外側(cè)，頸外動脈在前內(nèi)側(cè);還可根據(jù)頸內(nèi)動脈和迷走神經(jīng)包裹在動脈鞘內(nèi)來判斷，也就是說與迷走神經(jīng)伴行的血管一定是頸內(nèi)動脈。

改良線栓法中使用體視顯微鏡和留置針等技術，操作更快、更容易，模型成功率更高。該方法的優(yōu)點包括:①全程在體視顯微鏡下操作，使血管和神經(jīng)甚至分支都看得非常清楚，避免了人為損傷。在使用體視顯微鏡之前，MCAO模型制作中曾經(jīng)出現(xiàn)過模型雖然成功但是大鼠的氣管卻總是發(fā)出“吼吼”的聲音，后經(jīng)檢查，發(fā)現(xiàn)其原因是損傷了迷走神經(jīng)或其分支，尤其在夾閉頸內(nèi)動脈時一些細小的神經(jīng)肉眼是看不到的，或者因為視野受限將未看見的神經(jīng)部分一起夾閉。在使用體視顯微鏡操作后上述現(xiàn)象極少出現(xiàn)。本研究改良組1只大鼠發(fā)生神經(jīng)損傷，是因為在分離神經(jīng)和血管時鑷子末端不圓頓而損傷神經(jīng)所致。我們的結(jié)論雖然兩組在神經(jīng)損傷上差異沒有統(tǒng)計學意義，但如果排除這1只器械原因引起損傷外應該還是具有統(tǒng)計學差異的，所以結(jié)論上我們認為改良方法可以減少神經(jīng)損傷的發(fā)生。②在體視顯微鏡下植入線栓時可以清楚地看見線栓進入頸內(nèi)動脈以及進入標志處，使手術更加容易。③自制拉鉤的應用使手術視野暴露得非常好，但是由于肌肉具有彈性，必須讓拉鉤能剛剛阻擋住肌肉回縮即可，牽拉強度不能太大，以免損傷其他組織。④在進行血管刺破時，使用鑷子固定血管代替絲線牽拉。鑷子固定血管非常穩(wěn)固，血管不會滑動，也不會翻動，節(jié)省時間;絲線牽拉很容易出現(xiàn)血管滑動和翻動，不利于后面的操作。⑤插入線栓時仍需要將鑷子置于原來的位置不動，一方面血管不動容易看見其上面的破孔，有利于線栓的進入;另一方面，鑷子的末端由兩個分叉組成，遠心端的分叉還能起到阻斷血流、止血的作用，減少出血的幾率。

本研究改良組造模成功率明顯高于傳統(tǒng)組，神經(jīng)損傷、手術時間、術中出血均少于傳統(tǒng)組。造模成功率提高除了與應用顯微外科技術有關外，還與術者手術經(jīng)驗和技術水平有關，所以要求進行此模型制作的人員應先進行外科操作方面的培訓，以進一步提高造模成功率。

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